N1パーフュージョン — フェッドバッチ（流加培養）生産プロセスの改善方法

ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターを用いた強化されたN-1パーフュージョンシード培養アプローチが、生産用バイオリアクターでの高密度シードをどのようにサポートするかを示す概念実証データを紹介します。この記事では、従来のN-1シードトレインステップを高密度灌流に置き換え、生産用バイオリアクターを従来のランに比べて10倍のシード密度でシードすることができることを紹介します。

モノクローナル抗体を発現させたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を、HyClone™ ブランド ActiPro™の培地を使用し、HyClone™ ブランドのCell Boost™ Supplement 7aとCell Boost™ Supplement 7bを使用しています。バッチ細胞培養は、最初はシェイクフラスコ（SF）で行い、その後ReadyToProcess WAVE™&tradeにスケールアップしました。25バイオリアクター培養（N-1ステップ）にスケールアップした後、生産用バイオリアクターであるXcellerex™ XDR-500に移しました。

ここで紹介する方法は、増殖や力価プロファイルに影響を与えることなく、生産期間を短縮することで、フェッドバッチプロセスを強化することができます。生産期間の短縮により、生産施設でスケジュール可能な年間実行回数が増加し、生産バイオリアクターの数を増やすことなく、生産能力を向上させることができます。

はじめに

プロセス・インテンシフィケーションとは、設備を最大限に活用し、生産量を増加させる戦略のことです。これには一般的に連続処理の設計が含まれますが、安定したタンパク質生産においては、フェッドバッチ培養が依然として主流です。したがって、哺乳類細胞培養を用いたバイオ製造において、フェッドバッチプロセスを強化する戦略は、生産性の向上とコストの削減につながる可能性があります。

灌流（パーフュージョン）プロセスは、高い生存率での指数関数的な成長を維持しながら、高い細胞密度をサポートするため、生産プロセスだけでなく、シードトレインの強化にも適しています。細胞密度が最大で10倍になることで、シードリアクターのサイズや数を減らすことができ、施設の設置面積や投資コストを削減することができます。

最終的に高い細胞密度でフェッドバッチ生産のバイオリアクターに播種することで、力価が低いフェッドバッチ生産の初期成長段階を、より小型でコストの低いN-1種培養リアクターに移行させることができます。これにより、力価が変わらないまま生産期間を短縮することができます。この戦略により、生産チェーンのボトルネックが解消され、体積収率が向上するため、フェッドバッチのバイオ製造プロセスが強化されることになります。

本記事では、N-1パーフュージョンプロセスを強化することで、生産用バイオリアクターの高シード化をサポートし、生産期間を短縮できることを示す概念実証データを紹介します。我々は、ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターで行われたN-1パーフュージョンを用いて、Xcellerex™ XDR-500を基準培養の10倍のシード密度で播種したところ、生産工程の期間が3日（d）短縮されました（Fig 1参照）。

なお、この記事ではWAVE™25を用いたN-1パーフュージョンについて説明していますが、Xcellerex™Automated Perfusion System (APS)を用いて、容量> 25 Lの自動N-1灌流をXDRバイオリアクターと組み合わせることができます。

Fig 1. 研究で評価された従来型と強化型の高密度シードプロセスの概要。

詳細な素材と方法については、ページ下部をご覧ください。

結果と考察

ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターにおける高密度灌流プロセスの開発

N-1パーフュージョンプロセスは、ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターをパーフュージョンモードで動作させて開発・実行しました。灌流バッグでは、培養表面に浮かぶ公称孔径7 µmの一体型フィルターによってリアクター内に細胞が保持されます。

灌流速度は内蔵されたロードセルで制御され、同量の飼料と収穫物を定期的に添加・除去することができます。また、フィルターを内蔵しているため外部に再循環ループを設ける必要がありません。Fig 2に灌流システムの概略図を示します。

Fig 2. ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクターでのN-1パーフュージョセットアップ。.

灌流において重要なのは、培地の更新と除去の速度、すなわち灌流速度である。目的は、継続的な栄養分の添加と副産物の除去により、細胞にとって好ましい環境を一定に保つための灌流速度を確保することである。CSPR（Cell-specific perfusion rate）と呼ばれる灌流法では、細胞数や日にちに応じて灌流液を加えることで、効率的に一定の環境を保つことができ、培地の消費量を抑えることができます。

シード・トレイン・バッチを灌流プロセスに置き換える場合、培地消費量の増加と、それに伴うコストやフットプリントへの影響を考慮しなければなりません。そのため、増殖速度とメディア消費量のバランスを考慮して、灌流プロセスを慎重に最適化する必要があります(1)。灌流速度を最小限に抑えることの重要性は、異なるCSPRを用いて50 Lスケールで100×10⁶ cells /mLに到達するための培地消費量を比較することで明らかになります。 — CSPRが140 pL/cell/dの場合、1130 Lの培地を消費するのに対し、CSPRを40 pL/cell/dに下げると、320 Lの容量で済みます。

40〜120×10⁶ cells/mLの細胞密度で、2〜5リアクターボリューム（RV）の範囲で培地を消費するN-1パーフュージョンプロセスについては、これまでに説明してきました（2,3）。我々は、最小の灌流速度で指数関数的な増殖を維持できる灌流速度を特定するために、作業容積5Lの10L灌流バッグでプロセス開発を行いました。最終的には、最終培養量の半分の量で2日間細胞を増殖させた後、リアクターの全作業量に培地を添加するという手順をとりました。

2×10⁶ cells/mLの細胞密度、40CSPRの灌流速度で灌流を開始した。Fig 3は、この灌流速度によって、培養全体で指数関数的な成長が可能になったことを示しています。

Fig 3. ReadyToProcess WAVE™ 25バイオリアクター、25L作業容積（緑）および5L作業容積（青）におけるN-1パーフュージョンプロセスの成長プロファイル（100万個/mLの生細胞密度およびパーセントの生細胞率）。

最終工程では、50 Lの灌流バッグにスケールアップして灌流しました。細胞は、25 Lの作業容積で、70×10⁶ cells/mLの細胞密度（98％生存率）になるように灌流し、平均集団倍加時間は30時間でした（Fig 4）。灌流液の総消費量は107Lで、合計4.3RVに相当しました（Fig 4）。

Fig 4. ReadyToProcess WAVE™25のバイオリアクターの容量と培養期間中の灌流液。

従来のフェッドバッチと比較した高種子フェッドバッチ

ハイシード・フェッドバッチによるプロセスの比較可能性と効率向上を評価するためのベースラインとして、バッチでN-1を用いた従来型のシードトレインと、0.8×10⁶ cells/mLの細胞密度でシードしたXDR-500製造用バイオリアクターを用いた実験を行いました。増強プロセスでは、N-1パーフュージョン培養液を用いて、従来プロセスの10倍となる8×10⁶ cells/mLの細胞密度でXDR-500製造用バイオリアクターに播種しました。従来と同等の細胞密度を維持したまま、シームレスな移植を実現するためには、接種時の培地に十分な栄養分を供給する必要があります。シェイクフラスコでの最適化に基づき、高種子培養の培地にCell Boost™ 7a SupplementとCell Boost™ 7b Supplementを毎日のボーラス給餌に相当するレベルでスパイクしました。

Fig 5とFig 6は、2つのプロセスの成長と生産性を重ね合わせたものです。Fig 5の成長曲線を見ると、シーディング後の成長率は失速することなく維持されています。高種子の成長プロファイルは従来のプロセスと同じで、VCDのピークも同程度です。顕著な違いは、ピークに達するのが従来のプロセスよりも3日早いという事です（Fig 5）。同等のmAb製品の力価は、プロセス期間が3日違うだけで達成できます（Fig 6）。したがって、ハイシードプロセスは製造期間を33％短縮することができます。

この結果は、生産プロセスを変えることなく、成長期から定常生産期への移行をより速く行うことで、同じ生産目標をより短時間で達成できることを明確に示しています。

Fig 5. XDR-500バイオリアクターにおける従来のシード（緑）と高シードのフェッドバッチプロセス（青）の成長プロファイル。

Fig 6. XDR-500バイオリアクターにおける従来のシード法（緑）と高シードのフェッドバッチプロセス（青）の力価プロファイル。

節約できる日数は、細胞株とその高密度播種能力に大きく依存します。細胞株によって、指数関数的な成長を維持できる種子密度の範囲が異なります。従来のプロセスとハイシード・プロセスのシード密度のギャップが大きいほど、より多くの日数を節約することができます。

Table 1は個体数の倍増時間を24時間と仮定した場合に従来のプロセスの種子密度に対する高種子プロセスの種子密度の違いによって節約できる日数を推定したものです。

Table 1. ハイシードが従来の播種に比べて節約できた日数の試算

プロセス・エコノミー

ハイシードによる生産プロセスのランタイム短縮は、生産施設でスケジュール可能な年間ラン回数を増やし、結果的に生産用バイオリアクターの数を増やすことなくキャパシティを増やすことができます。

実際の最大製造バッチ数／年は、N-1種培養の期間とターンアラウンドタイム、製造プロセスの期間とターンアラウンドタイム、利用可能な製造装置と種のバイオリアクターの比率に依存します。

Fig 7のデータによるとフェッドバッチプロセスの4dをシードトレインに移行することで、60日間のバッチ数が3から4に増加し33%の能力向上が見られました。このタイプのスケジューリングでは、バッチからバッチへ、あるいは薬剤から薬剤への移行が可能な間隔に影響するため、施設のレイアウトも考慮する必要があります。

Fig 7. 単一のバイオリアクター施設で、従来型またはN-1パーフュージョン式ハイシードプロセスを用いた場合のスケジューリング。

年に培養するバッチ数が増えると、下流の容量に対する要求が高まります。

Table 2は、プロセス期間とバイオリアクターの数に応じて変化する収穫物のインターバル期間の詳細を日単位で示したものです。バイオリアクターの数が少なく、生産工程が長い施設では、収穫間隔が長くなっています（緑色で表示）。下流のキャパシティに挑戦することなく、より短い生産プロセスを導入することができます。したがって、CMOのような小規模な施設では、高シードのフェッドバッチプロセスを導入してプロセス能力を強化するメリットが実現しやすいと言えます。

しかし、生産工程の期間が短く、バイオリアクターの数が多い施設では、インターバルの期間が短くなってしまいます（赤で示した部分）。このままバッチ数を増やしていくと、設備レイアウトの変更や下流ラインの増設など、収穫量を増やすための対策を講じなければ、下流工程でのボトルネックになってしまう可能性があります。

Table 2. 最大14日間のプロセス期間と最大6つの生産バイオリアクター（BR）に応じた収穫の間隔

結論