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Biacore™で結合活性を検出できずELISAで検出できた経験があります。感度の問題でしょうか？

一般的に二次抗体や基質による増感を行うためELISAのほうが高感度であることが多いようです。ただし、親和性の低い分子などでは、Wash作業などで外れてしまう問題などもあり、検出分子により感度が逆転するときもあります。

biacoreで全く反応が見られなかったときに原因の特定が難しいと感じます。検討すべき項目がはっきりしているとありがたいと思います。

相互作用を有するはずなのに全くレスポンスが見られない理由としては以下があります。

1. 固定化量が十分でない。
2. 固定化分子が結合活性を失っている（変性している）
3. アナライトの濃度が十分でない。

1. 理論的Rmaxを計算して、十分なレスポンスが観察できるだけのリガンド分子の固定化量を固定化してください。
2. リガンドのストック溶液の品質の問題か固定化に伴い変性した可能性があります。固定化方法についてはより固定化分子にダメージを与えるリスクが低い、キャプチャー法を検討してください。
3. 1:1相互作用において相互作用のKD値と同じ濃度を添加したときの平衡値におけるレスポンスは1/2Rmaxになります。想定されるKDに対して十分な濃度かどうかを確認してください。

直接法の固定化において、濃度定量とカイネティクス解析のどちらも行いたいときは固定化レベルをどの程度にすれば良いのでしょうか。それぞれの用途に合わせてセンサーチップを複数使った方が良いのでしょうか

直接法の固定化において、同一の固定化レベルで濃度定量とカイネティクス解析の両方を行っていただくことは困難です。T200などアクティブのフローセルが複数ある場合には、それらを用途に合わせて使い分けてください。また、リガンドの付け替えが可能なキャプチャー法であれば同一フローセルを使いまわしていただくことも可能です。

p28固定化量が多い場合、ka、kdが正確に出なくてもアフィニティーは算出されますか

各濃度のセンサーグラムにおける結合領域が平衡値に達していれば、アフィニティー解析を実施して、KD値を求めていただくことが可能です。

CFCAのフィッティングモデルを教えてください。

通常のKD値を算出するときに用いる1:1 binding のモデル式（現行の機種においてはこのモデル式の中にMTL補正式が含まれています）を用いています。

直線性の高いダイナミックレンジはどれくらいですか。直線性の範囲を広げる方法はありますか。

直線性のある部分ですと3桁程度のレンジになります。 直線性を重視する場合、センサーグラムの結合初期の直線的な部分をレポートポイントに用い、ResponseでなくSlope（傾き）をプロットすることで検量線を作成するケースがあります。
結合初期はほとんどがフリーなリガンドですので、検体濃度と傾きが比例関係にありますので直線性が良くなります。また固定化量を高くすることでMTL（マストランスポートリミテーション）の影響を強くすることができますので、直線性が上がります。

CFCAは1:1 bindingで解析するとのことですが、抗体をアナライトとして解析して良いのはなぜですか？

基本的に固定化量を多くして、（ほぼ完全に）拡散律速でリガンドへ結合していく環境での測定が前提ですので、多価の分子を検体として流していただいても構いません。

センサーチップProAやGを使って抗体のCFCAは可能ですか？

Biacore™ T200のVer3.0以降ですと対応可能です。
CFCAでは通常リファレンスを差し引いた2-1のデータを用いますが、Sensor chip Protein Aや Protein Gで抗体濃度を測定する場合、リファレンスが取れませんので、Fc2のみのデータだけで解析します。
特にクルードなサンプルの場合、バルクやノンスぺの影響を極力抑えるために十分に希釈していただく必要があります。

お問い合わせありがとうございます。
後ほど担当者よりご連絡させていただきます。