バイオダイレクトメール vol.11 Technical Tips
＜mRNAの精製方法＞
RNAを使用する実験といえばノーザンブロッティングやcDNAの合成、マイクロアレイなどがあげられます。これらの実験はtotal RNAを用いることも可能ですが、ｍRNAを用いることでより正確に行うことができます。ｍRNAは3'側にPoly(A)が付加されているため、Poly(T)が結合したビーズやカラムに結合させることで精製することができます。
mRNAの精製にはtotal RNAを抽出してからmRNAを精製する方法と、細胞や組織から直接mRNAを抽出する方法があります。いずれの場合もRNaseによる分解を防ぐ必要があります。細胞や組織から抽出する場合、細胞内に存在するRNase特に注意を払う必要があります。
通常、変性剤（フェノール、LiCl、SDS等）やRNaseの阻害剤（ヘパリン、iodoacetate、polyvinyl sulfate、aurin tricarboxylic acid等）を加えて精製します。変性剤・阻害剤として最も適しているのはグアニジン塩で、一般的にはグアニジンチオシアネートが用いられます。ただし、グアニジン塩はOligo（dT）とmRNAの結合力を低下させるため、RNaseの活性を阻害しかつOligo（ｄT）との結合能を阻害しない適切なグアニジン濃度を検討する必要があります。
次に紹介するキットのプロトコールでは細胞を溶解する際には4-5 Mのグアニジン塩に溶解し、Oligo(dT)と反応させる前にグアニジン塩濃度を1.5 Mに希釈することを推奨しています。
