抗体精製をマスターしよう　（7）

HiTrap™ Protein G と用いた精製操作

HiTrap™ Protein G を用いた精製操作は、ポリクローナル抗体精製時と同じです。リンク先をご参照ください。
抗体精製をマスターしよう (6)　「HiTrap™ Protein G を用いた精製操作」の項

モノクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例

原料となる腹水やハイブリドーマ細胞培養上清は、IgG 以外のタンパク質をほとんど含みません。そのためProtein A やProtein G をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーにより、ワンステップで高純度な抗体を精製することができます。また、IgG は濃縮して溶出されることからハイブリドーマ細胞培養上清のように大量の原料からモノクローナル抗体を精製する場合において、最も好まれている精製手法の1 つです。

ポリクローナルIgG の精製と同様に、動物種やサブクラスによってProtein A とProtein G に対する親和性が異なりますので担体を使い分けます。抗体とProtein A またはProtein G の親和性の詳細は、第1回でご紹介した「図6　代表的な抗体クラスの生物学的性質」 をご参照ください。

マウス　モノクローナルIgG

10 ml のマウスハイブリドーマ細胞培養上清から抗EPO（EPO：Erythropoietin）モノクローナルIgG2b を、MAbTrap™ Kitで精製した例を紹介します。精製はキットに付属のシリンジを使ったマニュアル操作とペリスタルティックポンプによる操作の両方で行いました。方法によって回収量に差は認められないことがわかります。

図1　マウス モノクローナルIgG2b の精製（ポンプ使用）

試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分の中和を行いました。

• サンプル：マウスハイブリドーマ細胞培養上清（10 ml）
• カラム： HiTrap™ Protein G 1 ml
• 結合バッファー： MAbTrap™ Kit 結合バッファー（10倍希釈して使用）
• 溶出バッファー： MAbTrap™ Kit 溶出バッファー（10倍希釈して使用）
• 中和バッファー： MAbTrap™ Kit 中和バッファー
• システム：　ペリスタルティックポンプ
• 流速： 2.0 ml/min（312 cm/h）

図2　各画分のSDS-PAGE分析（非還元）

• ゲル：PhastGel™ Gradient 10-15
• 泳動システム：PhastSystem™
• 染色：銀染色
• アプライ量：1 µl

1. LMW分子量マーカー
2. マウスハイブリドーマ細胞培養上清（11倍希釈）
3. 素通り画分（10倍希釈、ペリスタルティックポンプ使用）
4. 溶出画分（3倍希釈、ペリスタルティックポンプ使用）
5. 素通り画分（3倍希釈、シリンジ使用）
6. 溶出画分（3倍希釈、シリンジ使用）

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。
↓
7 ml の結合バッファーで洗浄、5 ml の溶出バッファーで抗体を溶出しました（試験管には前もって75 µlの中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました）。
↓
最後に5 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

ヒト化　モノクローナルIgG4

血清を含むハイブリドーマ細胞培養上清（30 ml）から11.2 mg のモノクローナルIgG4 をHiTrap™ rProtein A で精製した例を紹介します。

リガンドの rProtein A は、天然型Protein A のalbumin 結合領域を遺伝子工学的に除去して大腸菌で生産した組換え体タンパク質です。血清を含むハイブリドーマ細胞培養上清や抗血清からの抗体精製で威力を発揮します。SDS-PAGE の結果、サンプル中に含まれるalbumin は素通りし、溶出画分のIgG4 の純度は95 % 以上（SDS-PAGE）であることがわかりました。回収率は93 % でした。

※サンプルはDr. J. Bonnerjea, LONZA Biologics plc, UK より寄贈いただきました

図3　ヒト化モノクローナルIgG4 の精製

サンプルを添加後、10 ml の結合バッファーで洗浄、5 ml の溶出バッファーで溶出しました。

• サンプル：12 mg ヒト化モノクローナルIgG4 を含む30 ml のハイブリドーマ細胞培養上清 （0.45 µm フィルター処理）
• カラム： HiTrap™ rProtein A 1 ml
• 結合バッファー： 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
• 溶出バッファー： 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0
• 中和バッファー： 1 M Tris-HCl, pH 9.0
• 流速： 1.0 ml/min（156 cm/h）

図4　溶出画分のSDS-PAGE分析（非還元）

• ゲル：PhastGel™ Gradient 10-15
• 泳動システム：PhastSystem™
• 染色：銀染色
• アプライ量：1 µl （各サンプルを15 ％ SDS, 60 mM Tris, 6 mM EDTA, 0.06 ％ Bromophenol Blue, pH 8.0 で5倍希釈）

1. LMW分子量マーカー
2. ハイブリドーマ細胞培養上清
3. 素通り画分
4. 溶出画分

ラット　モノクローナルIgG の精製

ラットのIgG はProtein A には結合しないので、Protein G で精製します。10 ml のラット ハイブリドーマ細胞培養上清から抗CD4 モノクローナルIgG2b をProtein G Sepharose™ 4FF 担体で精製しました。

図5　ラット モノクローナルIgG の精製

• サンプル：ラットハイブリドーマ細胞培養上清（25 ml）
• カラム： Protein G Sepharose™ 4FF （1×1.2 cm）
• 結合バッファー： 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
• 溶出バッファー： 0.1 M グリシン-HCl, pH 2.7
• 中和バッファー： 1 M Tris-HCl, pH 9.0
• 流速： 0.8 ml/min（61 cm/h）

図6　溶出画分のSDS-PAGE分析（非還元）

• ゲル：PhastGel™ Gradient 10-15
• 泳動システム：PhastSystem™
• 染色：銀染色

1. LMW分子量マーカー
2. 細胞培養上清
3. 溶出画分（0.16 µg）

酸性条件に不安定なモノクローナルIgG の精製

イオン交換クロマトグラフィーを用いたモノクローナルIgG 精製プロトコール

Protein G やProtein A を使用した抗体のアフィニティー精製では、溶出に酸性バッファーを使用するため抗体が失活する危険性があります。このような酸に不安定な抗体の場合には、中性付近のバッファーで精製するイオン交換クロマトグラフィーが適しています。

ここでは、HiTrap™ イオン交換 1 ml カラムの場合のプロトコールをご紹介します。5 ml カラムを使用する場合は、流速およびバッファー使用量を5 倍にしてください。

準備するバッファー

陰イオン交換体（Q, DEAE）

• 開始バッファー：　20 mM Bis-Tris propane, pH 9.5
• 溶出バッファー：　20 mM Bis-Tris propane, 1 M NaCl, pH 9.5

陽イオン交換体（S, SP, CM）

• 開始バッファー：　50 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.0
• 溶出バッファー：　50 mM MES, 1 M NaCl, pH 6.0

サンプルの調製

イオン交換担体はProtein A やProtein G よりも大きな吸着容量があります。大量に添加すると溶出時の抗体濃度が高くなり、凝集することがあるため、カラムへの添加量は10 mg程度までとします。

サンプル中の不純物や不溶物を除去し、HiTrap™ Desalting カラムで結合バッファーに交換します。サンプル量が10 ml を超えるような場合は、サンプルのpH を上記結合バッファーpH に合わせてください。

清澄化についての詳細：抗体精製をマスターしよう (4)　「サンプルの清澄化」の項

HiTrap™ イオン交換カラムを用いた精製操作

カラムの準備

カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジまたはシステムに接続し、5 ml の超純水を流速1 滴/ 秒（または1 ～ 2 ml/min）で送液

カラムの平衡化

5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒（または1 ～ 2 ml/min）で送液

サンプルの添加

調製したサンプル溶液を流速1 滴/ 2 秒（または0.2 ～ 1 ml/min）で送液

非吸着成分の洗浄

5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒（または1 ～ 2 ml/min）で送液

素通り画分は廃棄せずに回収し、精製終了後にSDS-PAGE やEIA によってIgG が素通りしていないことを確認します。

サンプルの塩濃度が高すぎる場合、イオン交換カラムを素通りする場合があります。予備実験で希釈の必要性を確かめてください。

抗体の溶出

グラジエント溶出

0 ～ 50 % 溶出バッファー（Total 20 ml）でリニアグラジエントを形成して溶出

溶出液を0.5 ml ずつ回収

大部分のIgG の等電点は、Albumin や Transferrin（pI 4.7 ～ 5.0 付近）より塩基性のpI 5 ～ 9.5 です。陽イオン交換カラムにIgG を結合させ、弱く結合したAlbuminや Transferrin を15 % 溶出バッファーで溶出させて除去します（ステップワイズグラジエント）。

pH 6.0 のバッファーでは、IgG は正に、Albumin やTransferrin は負に荷電しています。正電荷をもったIgG は陽イオン交換体に結合し、負電荷をもつAlbumin やTransferrin はカラムを素通ります。

溶出画分の確認

SDS-PAGE の結果より純度が不十分であった場合には、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製を行います。

精製IgG
↓
バッファー交換
↓
カラムの洗浄・保存