His-tagタンパク質精製の効率アップ！
～カラム中でリフォールディングしませんか？～
His-tag組換えタンパク質は、変性条件下でもアフィニティー精製により高い
特異性をもって回収できる便利なタンパク質ですが、機能解析や構造解析に持ち込む
ためには、精製後に別途リフォールディングさせることが必要で、手間がかかります。
ここではHis-tag精製のカラム中でリフォールディングを行い、実験の効率を高める
方法をご紹介します。みなさんご存知ですか？ もしまだ試されたことがなければ、
この機会にぜひお試しください。
はじめに
His-tagタンパク質は変性条件下でもアフィニティー精製できる特殊な組換えタンパク質です。
通常、組換えタンパク質が大腸菌内で封入体として発現された場合、 精製するためにはウレアや塩酸グアニジンなどの変性剤を添加して強制的な可溶化が必要になります。この工程によりタンパク質は固有の立体構造を失います。しかし、実際のタンパク質は3次構造や4次構造といった立体構造をとって機能する （活性をもつ）ため、変性状態では次の機能解析や構造解析に使用できない場合が 多いのです。
そこで、精製後にリフォールディング（再構築）が行われます。 一般的には、
■ 透析により精製サンプル溶液から徐々に変性剤を除いてリフォールディングさせる
■ 試験管やビーカー内のバッファーにサンプルを少しずつ滴下し、低サンプル濃度で リフォールディングさせる
といった方法が行われます。 しかし、これらの精製後のリフォールディング手法は手間がかかり、必ずしも効率的とはいえません。そこで、ここでは精製カラム内でリフォールディングを済ませるアプリケーションをご紹介します。
カラム内でのリフォールディング方法
本アプリケーションでは、以下の手順でリフォールディングを行っています。
詳細はこちらの資料からご覧いただけます。
1. 塩酸グアニジンで可溶化したサンプルをHiTrap™ Chelatingカラムに添加
2. Ureaで洗浄
3. Ureaの濃度をリニアグラジエントにより徐々に下げカラム内リフォールディング
4. リフォールディング後にイミダゾールによるグラジエント溶出
本アプリケーションノートにおいては、HiTrap™ chelatingを使用していますが、 新しく発売されたHisTrap™やNi Sepharose™でも同様の手法で行うことができます。 タンパク質によっては、その特性上プロトコールに改変を加える必要がある場合があります。 クロマトグラフィー以外の方法でうまくいかない、あるいはクロマトグラフィーを もっと活用したいと考えられている方は一度お試しください。
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