お客さまの声・データ紹介 - GenomiPhi™

培養困難な海水中単細胞真核生物のPCR

フォロー理由

推奨プロトコールより少ない100 細胞以下での増幅も含まれているため

フォロー状況

可能であれば増幅は1000 細胞以上で行うことをおすすめした上で、100細胞以下のサンプルから増幅したGenomiPhi™増幅産物を使用したPCR産物が、本当に目的のものかを、シークエンシング等で確認することをおすすめしています。

出発材料

天然の海水サンプル中の単細胞真核生物Ebria tripartita の18S rDNA配列

GenomiPhi™増幅産物を使用したアプリケーション名

PCR

実験方法

　1. GenomiPhi™使用ステップ

（A）使用機器・試薬

• EHB (TAITEC社)

（B）プロトコール

海水サンプル中からEbria tripartita の細胞をマイクロピペットで単離し、1、10、20、50、100細胞を用いて次のような組成で最初の変性反応(95 ℃、3分)をおこなった。

1、10、20細胞	50、100細胞
細胞＋微量の海水 Sample buffer 9 µl DDW 1 µl	細胞＋微量の海水 Sample buffer 9 µl ―

上記反応を行ったチューブにあらかじめ氷上で調製した酵素反応液（Reaction buffer 9 µl, Enzyme mix 1 µl）を加え、30 ℃で26時間反応させた。

　2. その後のアプリケーションのステップ

（A）使用機器・試薬

• iCycler (Bio-Rad社)
• rTaq DNA Polymerase (TOYOBO社)

（B）プロトコール

1st PCR

組成：	GenomiPhi™反応産物	0.5 µl
	Primer（20 nmol）	0.5 &mico;l each
	rTaqキット
		final 50 µl

反応

↑
ステップダウンPCR
（1サイクルにつき0.5 ℃ずつ温度を下げる）

2nd PCR

組成：	GenomiPhi™反応産物	0.5 µl
	Primer（20 nmol）	0.5 &mico;l each
	rTaqキット
		final 20 µl

2% TAEゲル泳動

PCR marker (Promega社)および2nd PCR産物それぞれ20 µlを2% TAEゲル中で泳動し、エチジウムブロマイドにて染色を行った。

結果 （下記画像をクリックすると拡大表示されます）

（１）

18S rDNA（部分；前半　約三分の一）

（2）

18S rDNA（部分；中間　約三分の一）

結果に対するコメント

Ebria tripartita は培養が困難であるため、これまで遺伝子の配列がわからず、分類学的に所属位置が不明の生物である。以前、一細胞を用いてPCRに挑戦していたが、PCR反応による増幅産物が得られなかった経験があるので、今回のGenomiPhi™の適用を試みた。
100細胞以下を使用したときには、やはりPCRの結果にばらつきが見られたが、一部はその後のシークエンス反応に使用することができると思われる。
また、100細胞における増幅が優秀であった点は大いに評価できる。というのも、これまでは、特に海水サンプルを用いる場合、100細胞をそのまま反応液に加えてPCRを行った場合、細胞とともに持ち込まれる海水量がどうしても多くなり、結果として海水中のさまざまな塩がバッファー組成に影響して、PCR反応そのものが阻害されるという問題があった。本キットを使用することで、この問題の解決を図ることができるため、培養困難生物の遺伝子解析に新しい道を開くことができる可能性がある。

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