お客さまの声・データ紹介 - GenomiPhi™
ご所属：広島大学大学院 生物圏科学研究科 分子生命開発学講座 細胞生理化学研究室
お名前：国吉久人先生
本キットの良いと感じている点
- 反応が簡便
- 再現性が良い
- 予想以上にゲノムDNAが増幅される
出発材料
エタノール固定した魚卵１個から抽出したゲノムDNA
GenomiPhi™増幅産物を使用したアプリケーション
ゲノム中のマイクロサテライトをPCRにより増幅し、個体間の多系を調べて、親子判定を行う
実験方法
1、GenomiPhi™使用ステップ
（A）使用機器・試薬
（B）プロトコール
- 定法に従い、エタノール固定した魚卵１個ずつからゲノムDNAを調製し、100μlの滅菌水に溶解した。
- 260 nmの吸光度から、各魚卵のDNA溶液の濃度は1ng/μl前後であった。
- 溶液 1μl（約1 ngのゲノムDNAを含む）にキットのSample buffer 9μlを加えて、ヒートブロックで95℃、3分間インキュベートした。
- サンプル溶液を氷上にて急冷して、スピンダウンした。
- Reaction buffer 9μlとEnzyme mix 1μlを混ぜた液（計10μl）を加え、30℃、18時間インキュベートした。
- 65℃、10分インキュベートして、酵素を失活させた。
2、その後のアプリケーションのステップ
（A）使用機器・試薬
- 装置：Eppendorf™ Mastercycler gradient
- 試薬：宝酒造 TaKaRa Taq
（B）プロトコール
PCRは反応液 20μl のスケールで行った。具体的な組成は以下の通り。
| 添付の10 x buffer |
2μl |
| dNTP (2.5 mM each) |
1.6μl |
| primer-1 (10μM) |
0.3μl |
| primer-2 (10μM) |
0.3μl |
| TaKaRa Taq (5 U/μl) |
0.1μl |
genome DNA (約1 ng/μl）
またはGenomiPhi™反応液 |
1μl |
| 滅菌水 |
14.3μl |
以下のPCRを行った。
| 95℃, 1.5 min |
|
| ↓ |
|
| 95℃, 30s |
25 cycles |
| 63℃, 60s |
| 72℃, 30s |
| ↓ |
|
| 72℃, 2 min |
|
| ↓ |
|
| 4℃, overnight |
|
反応後、5μlをアガロース泳動（2％ agarose in 1 x TBE）に供した。
結果 （下記画像をクリックすると拡大表示されます）
（1） Figure 1
| lane 1: |
卵 No.1 |
ゲノムDNA |
1μl (1.3 ng) |
| lane 2: |
卵 No.2 |
ゲノムDNA |
1μl (1.2 ng) |
| lane 3: |
卵 No.3 |
ゲノムDNA |
1μl (0.9 ng) |
| lane 4: |
卵 No.4 |
ゲノムDNA |
1μl (1.6 ng) |
| lane 5: |
卵 No.5 |
ゲノムDNA |
1μl (1.3 ng) |
| lane 6: |
control DNA |
|
1μl (10 ng) |
| lane 7: |
マーカー |
|
|
| lane 8: |
卵 No.1 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
| lane 9: |
卵 No.2 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
| lane 10: |
卵 No.3 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
| lane 11: |
卵 No.4 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
| lane 12: |
卵 No.5 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
| lane 13: |
control DNA |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
（2） Figure 2
| lane 1: |
卵 No.1 |
ゲノムDNA |
1μl (1.3 ng) |
=> PCR |
| lane 2: |
卵 No.2 |
ゲノムDNA |
1μl (1.2 ng) |
=> PCR |
| lane 3: |
卵 No.3 |
ゲノムDNA |
1μl (0.9 ng) |
=> PCR |
| lane 4: |
卵 No.4 |
ゲノムDNA |
1μl (1.6 ng) |
=> PCR |
| lane 5: |
卵 No.5 |
ゲノムDNA |
1μl (1.3 ng) |
=> PCR |
| lane 6: |
control DNA |
|
1μl (10 ng) |
=> PCR |
| lane 7: |
マーカー |
|
|
|
| lane 8: |
卵 No.1 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 9: |
卵 No.2 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 10: |
卵 No.3 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 11: |
卵 No.4 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 12: |
卵 No.5 |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 13: |
control DNA |
GenomiPhi™反応液 |
1μl |
=> PCR |
| lane 14: |
template なし |
(negative control） |
|
|
結果に対するコメント
PCRのtemplateとして、ゲノムDNA溶液1μlをそのまま使った場合(lane 1-5)と、ゲノムDNA溶液1μlをGenomiPhi™反応に供し、その反応液20μlのうちの1μlを使った場合(lane 8-12)とで、ほぼ同程度の量のPCR産物（マイクロサテライトを含む領域）が得られた。ゲノムDNA溶液はtotal 100μlあるので、GenomiPhi™を使用しない場合は100回のPCRが行えるのに対して、GenomiPhi™を使用した場合は2000回ものPCR反応が行えることになる。従って、調べたいマイクロサテライトのlocusが非常に多い場合には、GenomiPhi™は極めて有効な手段であると考える。
