お客さまの声・データ紹介 - Ettan™ DIGE

ご所属：東京大学医科学研究所 　　細胞ゲノム動態解析（ビー・エム・エル） 　　寄付研究部門 お名前：小迫 英尊 先生、服部 成介 先生

■ 良いと感じている点
1. 操作がシンプルで、二次元電気泳動の経験がなくても有用なデータが得られる。
2. 定量性が極めて高く、リン酸化によるスポットシフトなどの微妙な変化も高感度に検出できる。
3. 化学蛍光検出法によるウェスタンブロットにより、標識された試料タンパク質と同時に抗原を検出できる。

■ 概要

細胞内シグナル伝達経路のひとつであるERK経路を活性化あるいは阻害した細胞からの抽出液を用いて、ERK経路に関与するタンパク質のリン酸化のによる変動ををEttan™ DIGEで検出しました。本実験では低発現量のリン酸化タンパク質を検出するために、粗抽出液をリン酸化タンパク質精製カラムで精製してからEttan™ DIGEでの検出を行いました。
ERK経路概念図（右）

■ 方法
ERK経路を薬剤で制御できるように遺伝子導入したNIH3T3細胞に対して活性化、阻害処理を行い、各々の細胞粗抽出液をPhosphoProtein Purification Kit (QIAGEN™)で精製し、Ettan™ DIGEで検出しました。また、解析したゲルを抗ERK抗体等でウェスタンブロットし、ECL™ Plus Western Blotting Detection Reagentを用いて検出を行いました。

■ 結果
同一ゲル上の2つの画像イメージ（ERK経路活性化、阻害）の比較から、ERK経路活性化によりリン酸化が増加したと思われるタンパク質が多数検出されました（赤いスポット）。また、このゲルをウェスタンブロットで解析したところ、赤いスポットに一致して複数のリン酸化ERKや下流因子のリン酸化が検出され、ERK経路を構成するリン酸化タンパク質がEttan™ DIGEで検出できることが確認されました。

上図 ERK経路活性化により変化したスポット ● ERK経路活性化により増加したスポット ● ERK経路活性化により減少したスポット ● ERK経路活性化により変化しなかったスポット

抗ERK抗体で検出されたスポット （左図の白丸で囲った箇所）

■ 結論
サンプルを適切な方法でプレフラクシネーションすることで目的の低発現量のタンパク質を濃縮し、Ettan™ DIGEで検出できることが示されました。また、リン酸化タンパク質のようにわずかなスポットシフトが生じた場合でも確実に検出できました。

お問合せフォーム

※日本ポールの他事業部取扱い製品（例: 食品・飲料、半導体、化学/石油/ガス ）はこちらより各事業部へお問い合わせください。