IN Cell Analyzer 2000を用いた幹細胞コロニー解析

はじめに

幹細胞研究は、さまざまな疾病に関する理解を深め、治療法に関する多くの知見が得られると期待されています。幹細胞はさまざまな表現型に分化する能力（分化全能性）を持ち、その分化能は培養条件に大きく依存しています。数多くの培養条件をこなすためマルチウェルプレートのようなフォーマットでの検討が必要となります。

その点、自動化された蛍光顕微鏡を有するイメージングサイトメーターでは、接着細胞であっても剥離する必要がなく効率的に作業できます。さらに細胞個々から蛍光強度の情報だけでなく形態情報、局在情報などのデータを取得できるという利点があります。形態情報から未分化の細胞及び分化した細胞を区別するというようなアプリケーションにも応用できます。

幹細胞は、通常、密集したコロニー状態で増殖し、幹細胞に特異的なOct-4などのマーカーに対する抗体で検出します。マルチウェルプレートを用いたコロニー解析においては、撮影視野の端でコロニーが切れてしまうことなく、また、出現頻度の低いコロニーでも漏らさず検出することが望まれ、そのためには一度にウェル全体が撮影できるシステムが必要です。

今回、large-chip CCDカメラと2×レンズ（0.1 NA）とを組み合わせてハイスループットでホールウェル撮影を可能にするIN Cell Analyzer 2000を用いて幹細胞のコロニー解析を行った例をご紹介します。フィーダー細胞とコロニーの自動識別や、細胞数のカウントやコロニー数、コロニー中の細胞数の自動カウントのほか、有糸分裂中のM期細胞の認識を行いました。

使用した製品

• IN Cell Analyzer 2000 Large Camera System … 細胞イメージ取得用装置（large-chip CCDカメラ内蔵）
• IN Cell Investigator Software … 解析用ソフトウェア
• IN Cell Analyzer 2000 2×0.1 NA Objective Lens

サンプルおよび試薬

• 幹細胞 および フィーダー細胞＊
• Hoechst™
• Fluorescein-conjugated antibody to Oct4
• Texas red-conjugated antibody to phospho-histone H3

＊Stem Cell Research Center, University of California, IrvineのPeter Donovan博士よりご提供いただきました。
※Hoechst™は核を染色する蛍光試薬です。Fluorescein-conjugated antibody detection to Oct4は幹細胞特有のマーカーOct4に特異的な抗体で、幹細胞を識別するために使用しました。Texas red-conjugated antibody to phospho-histone H3は細胞分裂時にリン酸化されるヒストンH3に特異的な抗体で、有糸分裂細胞を検出するために使用しました。

実験方法

96ウェルプレートに培養された幹細胞コロニーおよびフィーダー細胞を蛍光染色してから固定しました。核はHoechst™、幹細胞はFluorescein-conjugated antibody to Oct4、有糸分裂中（M期）の細胞はTexas red-conjugated antibody to phospho-histone H3で染色しました。詳細な手順や培養条件やの詳細は以下の論文を参照しました。

Elliott, A. et al., Identifying Genes Differentially Expressed Between PGCs and ES Cells Reveals a Role for CREB-Binding Protein in Germ Cell Survival. Dev Biol. 311 （2）, 347-358 （2007）.

Pyle, A.D. et al., Neurotrophins mediate human embryonic stem cell survival. Nature Biotechnology, 24, 344-350 （2006）

結果

IN Cell Analyzer 2000を用いて、2×レンズ（0.1NA）およびlarge-chip CCDカメラによるホールウェルイメージングを行いました（図1）。今回用いた96プレートのウェルサイズは直径6.5 mmに対し、視野サイズは7.6 mm四方となっています。解析ソフトウェアIN Cell Investigator Software（Developer toolbox）を用いて、Hoechst™の画像から全細胞およびOct-4の画像からコロニーを自動認識させました。さらに総細胞数のカウント、コロニー数のカウントおよびコロニー中の細胞数のカウントを行うことができます（図2）。

また、リン酸化ヒストンH3の免疫染色により有糸細胞分裂期の細胞をカウントすることができました（図3）。イメージングサイトメーターでは細胞、コロニーのカウントだけではなく、その形態を評価することが可能です。図3Cの1、2、3で示したコロニーに関して解析結果の一覧を示しました（表1）。目視では識別が難しい密集したコロニーであっても細胞のカウントや核の数、およびM期の細胞の検出を行うことができました。

図1 96ウェルプレート中の幹細胞コロニーおよびフィーダー細胞のホールウェルイメージ画像
（A）Hoechst™画像（幹細胞コロニーおよびフィーダー細胞）
（B）Oct4画像 （幹細胞コロニー）

図2 幹細胞コロニーおよびフィーダー細胞の画像解析
（A）Hoechst™画像（幹細胞コロニーおよびフィーダー細胞）。左下のウィンドウは全視野を示します。拡大表示している箇所を白囲みで示しています。
（B）Aの画像から核を認識したもの（赤でマーク）
（C）Oct4の画像からコロニーを認識したもの（黄色でマーク）
（D）BとDをあわせ、コロニー中の核を認識したもの（コロニーを黄枠、核を赤で囲みました。）

図3 コロニー中のM期細胞の同定
（A） Hoechst™ （青）, Oct4 （緑）
（B） phospho-histone H3（黒）
（C） 画像認識後の結果。コロニー（黄）、細胞（赤）、M期細胞（青）

コロニー番号	1	2	3
コロニーあたり細胞数	650	131	72
コロニーあたりOct-4陽性細胞数	649	133	67
コロニーあたりOct-4陽性細胞割合（%）	99.8	101.5	93.1
コロニーあたりM期細胞数	13	4	1
コロニーあたりM期細胞割合（%）	2	3.1	1.4
コロニー面積（µm2）	214092	68028	38816
コロニー周囲長（µm）	2876	1616	1009
コロニー1/真円率	0.33	0.33	0.48
コロニー平均直径（µm）	264	177	122
コロニー最大直径（µm）	444	305	199

まとめ

• IN Cell Analyzer 2000は幹細胞の蛍光画像取得の自動化が可能です。
• 2×レンズ（0.1NA）およびlarge-chipカメラを用いることで、96プレートのホールウェル撮影が可能です。
• 2×レンズを用いることで広視野かつ細胞のカウントに十分な画像解像度が得られます。
• コロニー中の細胞数、およびコロニー中のレアイベントの測定が可能です。

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