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第4章
タンパク質サンプル調製ワークフロー内での適合性の確保(2)

バッファー交換と脱塩(2)

■限外ろ過（Ultrafiltration：UF）(1)

限外ろ過では、孔径が小さく厳密に規定されているメンブレンに液体を押しつけます。孔よりも大きい分子はメンブレン上に残り（残余分）、孔よりも小さい分子と溶媒はメンブレンを通過します（ろ液）。ほとんどの場合、孔径は分子量カットオフ（MWCO）値として規定されます。繰り返し希釈した後、限外ろ過（膜分離精製）で容積を低減させることで、バッファー組成および小さい夾雑物の濃度を変更できます。

Vivaspin™サンプルコンセントレーターを用いたサンプルの濃縮

遠心分離ベースの限外ろ過（例：Vivaspin™サンプルコンセントレーターを用いた限外ろ過）は全プロセスを1本のチューブで行えます。このチューブは規定のMWCOを有する半透膜で上下のチャンバーが分離されており、上のチャンバーにサンプルを入れます。チューブを遠心分離すると、溶媒が半透膜を通過するため、上のチャンバーに残ったサンプルの濃度が上昇します。Vivaspin™サンプルコンセントレーターを使用すると、生物サンプルを最大30倍濃縮できます。目的分子の回収率は通常95%を超えます。Vivaspin™サンプルコンセントレーターは100 μlから20 mlのサンプルに使用でき、MWCO値の範囲はMr 3,000から100,000までです。4サイズのVivaspin™サンプルコンセントレーターの画像と容量範囲をそれぞれ図4.4と表4.1に示します。Vivaspin™ サンプルコンセントレーターは、バッファー交換と脱塩にも使用できます。Vivaspin™ 500を用いた濃縮とバッファー交換/脱塩のプロトコールを以下に示します。Vivaspin™ 500の性能特性については表4.2を参照してください。Vivaspin™シリーズの仕様はこちらを参照してください。

図4.4
図4.4　Vivaspin™ 500、2、6および20。4製品すべてにMWCO値3,000、5,000、10,000、30,000、50,000および100,000のモデルがあります。

表4.1　Vivaspin™サンプルコンセントレーターの容量範囲

Volume rangeProduct
100 to 500 µl Vivaspin™ 500
400 µl to 2 ml Vivaspin™ 2
2 to 6 ml Vivaspin™ 6
5 to 20 ml Vivaspin™ 20

Vivaspin™サンプルコンセントレーターに取り付けられているメンブレンには微量のグリセリンおよびアジ化ナトリウムが含まれます。万が一、これらの物質が分析に干渉する場合には、上限ラインまでバッファー液または脱イオン水をアプライし、コンセントレーターに通してメンブレンをすすぐことで除去できます。

上下のチャンバーの液を捨ててから、サンプル溶液を処理します。このコンセントレーターをすぐに使用しない場合には、バッファーまたは水でメンブレンの表面を覆って冷蔵庫で保管します。

メンブレンを乾燥させないでください。

高温になるとメンブレンのMWCOが大幅に増加するため、Vivaspin™デバイスはオートクレーブにかけないでください。滅菌する場合には、70%のエタノール溶液または混合滅菌ガスを使用します。

材料

Vivaspin™ 500サンプルコンセントレーター

最小角40度、チューブ容量2.2 mlの固定角遠心機

前調製

サンプルにもっとも適したメンブレンカットオフ値を選択します。回収率を最大限に高めるためには、目的タンパク質種の分子サイズより50%以上小さいMWCO値を選択します。

プロトコール -Vivaspin™ 500を用いた濃縮1-

固定角遠心機を使用します。標準的な微量遠心機の大半は、このプロトコールに適しています。詳細については製品使用説明書を参照してください。

  1. サンプル適用
    100～500 μlのサンプルを上のチャンバーに入れます。フタが十分密閉されていることを確認します。
  2. 遠心分離を用いた濃縮
    組み立てたコンセントレーターを遠心分離器にセットします。15,000 × gで5～30分間遠心分離します。詳細については製品使用説明書を参照してください。
  3. 濃縮済みの溶液の回収
    濃縮されたサンプルが上のチャンバーに残っています。

1 Vivaspin™ 500を使用した脱塩/バッファー交換のプロトコールは以下に示します。

表4.2　Vivaspin™ 500の性能特性

Protein FilterUp to 30-fold sample concentration1Recovery
Aprotinin 0.25 mg/ml (Mr = 6,500)
MWCO 3,000 30 min 96%
BSA 1.0 mg/ml (Mr = 66,000)
MWCO 5,000 15 min 96%
MWCO 10,000 5 min 96%
MWCO 30,000 5 min 95%
IgG 0.25 mg/ml (Mr = 160,000)
MWCO 30,000 10 min 96%
MWCO 50,000 10 min 96%
MWCO 100,000 10 min 96%

1 濃縮時間は20℃で500 µlをスタートのサンプルボリュームから30倍濃縮にした場合

 

＞＞バッファー交換と脱塩(3)

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