バイオダイレクトメール　vol.30 Technical Tips
＜組換えタンパク質精製をはじめよう＞Part 2

前号より3回のシリーズで、タンパク質の精製手法の一つである、組換えタンパク質を利用したアフィニティークロマトグラフィーの基礎講座をお送りしています。今回は、組換えタンパク質の代表例、GST融合タンパク質についてです。

GST融合タンパク質とは

GST融合タンパク質は、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子の3'-末端に目的の遺伝子を挿入して発現させます。弊社の大腸菌用発現ベクター pGEXシリーズは、Schistosoma japonicum （日本住血吸虫）由来のGST（26 kDa）のC末端に目的のタンパク質が結合するように設計されています。GST融合タンパク質発現には以下のような利点があります。

• GSTがキャリアーとなり、高い溶解性が期待できます
• GST活性やGSTに対する抗体を用いて容易に検出できます
• グルタチオンとの親和性を利用して簡単に精製できます
• 穏やかな条件で精製が可能なため、タンパク質の変性を最小限に抑えられます
• プロテアーゼ（PreScission™ Protease、ThrombinやFactor Xa）消化により目的のタンパク質だけを切り離すことができます

pGEXベクターに共通の特徴

pGEXベクターは、GST 遺伝子の下流にプロテアーゼ認識部位とマルチクローニングサイト（MCS）を持っています。目的の遺伝子の組込みが容易なだけでなく、発現したGST融合タンパク質から目的のタンパク質をプロテアーゼにより切り出すことができます。

また、高レベル発現系のtacプロモーター（Ptac）を採用し、IPTG添加によるタンパク質の誘導発現を行うことができます。laq Iq遺伝子をプラスミド上に持つので宿主大腸菌を選びません。

すべてのベクターには、宿主大腸菌としてプロテアーゼ欠損株のBL21（F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dem）が添付されています。

pGEXシリーズの全ベクターのマルチクローニングサイトとプロテアーゼ認識配列についてはFAQ（製品Q&A）をご参照ください。

ベクター選択ガイド

プロテアーゼ	ベクター	MCS＊1内の制限酵素サイト数	フレーム	その他の特徴
Thrombin 安価 非特異的切断の可能性	pGEX-4Tシリーズ	6	3種類＊2	-
	pGEX-2T	3	-	-
	pGEX-2TK	3	-	プロテインキナーゼ認識部位有＊3
	pGEX-1λT	2	-	EcoR I消化・脱リン酸化済＊4
Factor Xa 高い切断特異性	pGEX5Xシリーズ	6	3種類	-
	pGEX-3X	3	-	-
PreScission™ Protease GST融合プロテアーゼなので精製と同時に除去可能 反応至適化が5～15℃	pGEX-6Pシリーズ	6	3種類	-

＊1 MCS（マルチクローニングサイト）
＊2 1塩基ずつ読み枠をずらした3種類のベクターがあります。目的遺伝子のコドンとインフレームになるものを選択してください。
＊3 発現されたタンパク質をprotein kinaseと[γ-32P]ATP（コード番号：PB10235、PB10233）により標識でき、シンチレーションカウンターあるいはオートラジオグラフィーで検出できます。
＊4 ベクターをEcoR Iで消化後、脱リン酸化しています。EcoR Iでλgt11などのcDNAクローニングベクターに組み込んだDNAを直接サブクローニングするのに便利です。

GST融合タンパク質の精製

GST融合タンパク質は、さまざまな発現ベクター（例：pGEXシリーズ）により大腸菌を宿主として発現されます。すべての発現ベクターにはプロテアーゼ認識配列が導入されているので、プロテアーゼ消化を行うことで目的のタンパク質のみを得ることができます。発現に使用したベクターにより精製のスキームが異なります。以下に示す流れにしたがって、カラムあるいはバッチ法により操作を行ってください。

※次回のTechnical TipsではHis-tagタンパク質を取り上げます。

組換えタンパク質精製をはじめよう（3）

• 組換えタンパク質をはじめよう Part 1 （Technical Tips vol.29）
• 組換えタンパク質精製関連FAQ（製品Q&A）

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