抗体精製をマスターしよう　（9）

モノクローナルIgMの精製

第8回「モノクローナルIgGの高純度精製」では、効率的に高純度のモノクローナルIgGを精製するためのスキームについてご紹介しました。HiTrap™ IgM PurificationカラムはIgMが2-Mercaptopyridine にThiophilic interactionで結合する性質を利用した精製カラムです。2-Mercaptopyridineには、多数の血清中のタンパク質も結合するため、血清成分が含まれるサンプルからIgMを精製する場合には、他の手法も組み合わせて精製する必要があります。

• 無血清ハイブリドーマ細胞培養液からの精製
• 血清入りハイブリドーマ細胞培養液からの精製
• HiTrap™ IgM Purificationカラムによるアフィニティー精製例
• イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーによるモノクローナルIgMの精製

無血清ハイブリドーマ細胞培養液からの精製

HiTrap™ IgM Purification カラムによる精製

HiTrap™ IgM Purificationカラム（1 ml）のプロトコールです。5 ml 以上にスケールアップをする場合には、HiTrap™ IgY Purificationカラム（5 ml）を使用してください。また、以下のプロトコールの流速およびバッファー使用量を5倍にしてください。

準備するバッファー

• 結合バッファー：　20 mM リン酸ナトリウム, 0.8 M 硫酸アンモニウム, pH 7.5
• 溶出バッファー：　20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.5

サンプルの調製

1 ml カラムへの添加培養上清量の計算

培養上清中の抗体濃度は 0.01 ～ 0.5 mg/ml 程度です。カラムに添加するサンプル量は、下記方法で求めた最大添加量の1/2 までにします。
抗体精製をマスターしよう (5)　「結合容量とサンプル添加速度」の項

血清入りハイブリドーマ細胞培養液からの精製

血清入りハイブリドーマ細胞培養液から精製する場合、添加した血清由来のウシIgG が精製IgM に混入します。この場合、上述の操作でIgMをアフィニティー精製した後、混入したIgGをHiTrap™ Protein G に吸着させて除去します。

精製IgM中に存在するIgGの除去

HiTrap™ Protein G 1 ml カラムの場合のプロトコールです。5 ml カラムを使用する場合は、流速およびバッファー使用量を5倍にしてください。

準備するバッファー

• 結合バッファー：　20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0

サンプルの調製

精製IgM 溶液は HiTrap™ Desaltingカラムで結合バッファーに交換してください。

モノクローナル IgMの精製例

HiTrap™ IgM Purificationカラムは、IgMが2-MercaptopyridineにThiophilic interaction（Porath,1985）で結合することを利用した新しいアフィニティー精製カラムです。IgM以外のタンパク質を含まない無血清培養上清を出発材料とした場合には、ワンステップで高純度なIgMを精製することができます。

2-Mercaptopyridineは、血清中のイムノグロブリンやMacroglobulinなどと親和性をもつため、血清成分が多量に含まれるサンプルや血清からIgM を精製する場合は、イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせた精製が必要です。

HiTrap™ IgM Purificationカラムによるアフィニティー精製例

5％ FCS（ウシ胎児血清）を含むマウスハイブリドーマ細胞培養上清（75 ml）からモノクローナル抗赤痢菌IgMを精製しました。カラムは2-Mercaptopyridineをリガンドに持つHiTrap™ IgMPurificationカラム 1 ml を使用し、「イオン交換クロマトグラフィーを用いたモノクローナルIgG精製プロトコール」にしたがって精製しました。各ステップの回収画分の活性はELISA で、純度はSDS-PAGE とゲルろ過クロマトグラフィーで分析し、純度80 % 以上のIgMが回収されたことを確認しました。

ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より、純度80 % 以上のIgMがHiTrap™ IgM Purificationカラムによってワンステップで精製されていることが分かりました。

イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーによる精製例

イオン交換クロマトグラフィーは、高い分離能を示すため複雑な成分の分離に非常に有効な精製方法です。ここではFCSを含むハイブリドーマ細胞培養上清からIgM を精製した例を紹介します。pH 5.0 以上でAlbuminは陽イオン交換カラムを素通りしますが、モノクローナルIgMは種類によってカラムに吸着する場合があります。非吸着成分を洗浄した後、塩濃度のリニアグラジエントでIgMを溶出しました。さらにIgMの分子量（900 kDa）が夾雑タンパク質に比べて大きいことを利用して、ゲルろ過クロマトグラフィーにより最終精製を行いました。
（Dr. H.F.J. Savelkoul, Erasmus University, Rotterdam, The Netherlands より提供のデータ）

---

血清を添加した細胞培養液からの精製では、IgGが混入することに注意しましょう。精製純度をあげたい場合には、IgMの分子量が大きいことを利用し、ゲルろ過クロマトグラフィーを試してみるのが良いでしょう。

次回は、Yolk sac抗体IgYの精製プロトコールをご紹介します。