ウェスタンブロッティング こんなときどうする？
～汚れ、ムラについて～

回答：ウェスタンブロッティング担当

せっかくはっきりとバンドが得られてもバンドの周辺に黒い斑点や汚れ、ムラがあっては台無しです。汚れ、ムラはゴミなどのコンタミや洗浄が不十分なときに起こります。下表で各ステップにおける原因とその回避方法をお教えします。

 

	原因	解決策
ブロッティング	メンブレンに指紋やケラチンなどの不純物が吸着している メンブレンの親水処理が不十分	手袋やピンセットを使用する メンブレンには直接触れないよう、手袋を着用するか先の平らな（メンブレ ンを傷つけないようにするため）ピンセット（下図）を使用します。 　 新しいメンブレンを用いる 新しいメンブレンで親水化処理を行います。親水化が均一に行われていることを確認します。 メンブレンがバッファー上に浮かないよう確認する 親水化が不十分だとメンブレンが水面に浮いてしまい、バッファーに十分浸りません。先の平らなピンセットなどでメンブレンを沈めてバッファーに浸らせます。
抗体反応	メンブレンに指紋やケラチン など不純物が吸着している 二次抗体が凝集している 抗体溶液量が少ない バッファー洗浄が不十分	手袋やピンセットを使用する メンブレンには直接触れないよう、手袋を着用するか先の平らな（メンブレ ンを傷つけないようにするため）ピンセットを使用します。 二次抗体をフィルターでろ過する 凝集した二次抗体がメンブレンに吸着すると、斑点状のシミとして検出されます。二次抗体をφ0.2 μm フィルターでろ過するか、軽く遠心して上清を回収して凝集体を除きます。 抗体溶液量を増やす 抗体濃度を保とうとしてあわせてトータルの抗体液量を減らしてしまうと、ハイブリパックやトレイ内の処理でメンブレンに十分抗体溶液が行き渡らない ことがあります。その結果、メンブレンの部分部分で接触する抗体量にムラが生じてしまいます。少なくとも、液量の高さが容器底から5 mm程度になるよう、抗体溶液を準備します。 洗浄条件の検討 洗浄バッファーの量・洗浄回数を検討、 洗浄時間の延長、 Tween 20濃度を上げるなどを行います。
検出	検出試薬の除去が不十分	余分な検出試薬を除去する メンブレン上の過剰な検出試薬を除いてから検出します。

参考になりましたでしょうか。ぜひお試しください。

 

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