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複数タグのススメ【2】
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| ・Thrombin | |
| 比較的安価ですが、認識配列の特異性が低いという留意点があります | |
| ・Factor Xa | |
| 認識配列が比較的長めで、特異性は高いといえますが、二量体として挙動するため、還元条件下で機能することができません（GSTrapカラムなどで精製後に還元型グルタチオンを除去してから反応させる必要がある）。 | |
| ・PreSicssion Protease | |
| 認識配列が長く、低温で反応可能な点が特徴で、外の内在性プロテアーゼの活性を抑えつつタグ切断のみが行われることが最大のメリットです。更にPreScission ProteaseのN末端にはGST融合タンパク質が付加されています。 | |
ここでのポイントは、
- 切断の精度（正確さ）
- 切断したGSTの除去
- 使用したプロテアーゼの除去
になります。
切断精度は認識配列が長いという点でFactor XaやPreScission Proteaseが挙げられます。
切断したGSTの除去には、最初に組換えタンパク質を精製する時に使用するGlutathione Sepharose（Glutathione Sepharose 4 Fast Flowなど）を用い、素通り画分を回収します。
プロテアーゼの除去は、セリンプロテアーゼに分類されるThrombinやFactor XaはBenzamidine Sepharoseを用いて除去します。PreScission Proteaseは上述の通りGST融合タンパク質であるため、切断したGSTの除去と共にPreSiccion Proteaseも一緒に除去できる、とても便利なプロテアーゼです。
これから実験系をGST融合タンパク質で組み立てようと考えていらっしゃる方は是非お薦めのベクター・プロテアーゼの組み合わせです。
アプリケーション例などを知りたい、という方はガイドページをご訪問ください。
プロテアーゼの比較
| Thrombin | Factor Xa | PreScission | |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 37 kDa 単量体 |
48 kDa 二量体 |
46 kDa 単量体 |
| 認識配列 | P4-P3-Pro-Arg/Lys↓P1'-P2'（P3とP4は疎水性アミノ酸、P1'とP2'は非酸性アミノ酸） | Ile-Glu-Gly-Arg↓ | Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓Gly-Pro |
| P2-Arg/Lys↓P1'（P2またはP1'がGly） | |||
| 反応温度 | 室温 2～16時間 |
室温 2～16時間 |
低温 4～16時間 |
| プロテアーゼの除去 | Benzamidine Sepharose | Benzamidine Sepharose | Glutathione Sepharose |
| 還元剤 | 可 | 不可 | 可 |
精製スキーム
次回は、MBP融合タンパク質とStrep(II)-tagについて紹介します。
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