お客さまレビュー／データ紹介　illustra™ GenomiPhi™ DNA Amplification Kit その1

【データ紹介】　1　（全7件）

• 東京女子医科大学 医学部 法医学教室
  王　秀玲 先生
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※これらのデータは旧型製品で得られたデータ紹介例であり、現在は改良型のキットが販売されています。プロトコール等が異なりますので、紹介例は参考結果としてご参照ください。詳細につきましては、バイオダイレクトライン（03-5331-9336）までご連絡ください。

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東京女子医科大学 医学部 法医学教室
王　秀玲 先生

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit の良いところ

• 手間がかかりません。
• 1 ng以上のDNAを増幅することができました。
• 増幅産物をSNPs解析及びSTR解析することができました。

目的

法医学実務や犯罪捜査等で個人識別をするためにDNAを増幅しました。

サンプル

微量な毛髪、爪、唾液斑、精液斑、血痕

実験の流れ

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit で増幅した産物をABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit（SNPs解析用）およびAmpFlSTR Profiler PCR Amplification Kit (STR解析用)により遺伝子型を検出しました。

実験方法

1. 毛幹部（2 cm）、毛根部（0.5 cm）、爪（2 mg）、唾液斑（0.5 cm×0.5 cm）、精液斑（0.5 cm×0.5 cm）、血痕（0.5 cm×0.5 cm）をサンプルとし、ISOHAIR (NIPPON GENE)によるDNA抽出を行いました。
2. ゲノムDNA増幅：抽出された1ngのDNAをGenomiPhi™ DNA Amplification Kit で増幅しました。
3. ゲノムDNAの精製:増幅されたDNAをセントリコンー100で精製しました。

以上の方法は，添付のマニュアルにしたがって行いました。

【使用機器・試薬】

• PCR装置　（GeneAmp™ 2400）

GenomiPhi™ によるDNA増幅後のアプリケーションステップ

• 1.　8ローカスのSNPs解析

  SNPs解析は，マルチプレックスPCRによりテンプレートDNA増幅を行い，残存したプライマーとdNTPをShrimp Alkaline Phosphatase およびExonuclease I により除去しました。得られたPCR産物を鋳型にしてSNP部位の直前に3'末端がくるように設定したプライマーと4色の蛍光に標識したddNTPを含むSnaPshot Multiplex Kit を加えてラベル用のPCRを行い，その産物をABI PRISM Genetic Analyzer により分離し，付加された塩基の種類をその蛍光の色と移動度の違いで判定しました。

  • 1-1. マルチプレックスPCR増幅

    PCR反応は，ゲノムDNA10 ngを鋳型として，1× PCR Gold Buffer，0.2 mM dNTP Mix ，10 pmol の各Primers，0.125 unit AmpliTaq Gold™ Polymeraseを含む総量25 µl の反応液で95℃，10分間のプレヒート後， 94℃，15秒間で変性，65℃，30秒間でアニーリング，72℃，45秒間で伸長を35サイクル行いました。

  • 1-2. マルチプレックス一塩基伸長反応

    一塩基伸長反応は， 96℃，10秒間で変性，50℃，5秒間でアニーリング，60℃，30秒間で伸長を25サイクル行いました。

  • 1-3. キャピラリー電気泳動

    蛍光ラベルされた産物はABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いてキャピラリー電気泳動により，15ｋV，60℃，25分間の条件で分離しました。分離された電気泳動のパターンはGeneScan Softwareにより，蛍光の色と移動度の違いで型判定を行いました。

• 2.　9ローカスのSTR解析
  • 2-1. STR座位のPCR増幅

    ゲノムDNA 4 µl （40 ng）、PCR Reaction Mix (AmpliTaq Gold™ PolymeraseおよびProfiler Primers Setを含む）6.5 µl の反応液で95℃，11分間のプレヒート後、94℃，1分間で変性、59℃、1分間でアニーリング、72℃、1分間で伸長を28サイクルし、最後に60℃、45分間で伸長を行いました。

  • 2-2. キャピラリー電気泳動

    増幅された産物はABI PRISM 310 Genetic Analyzerを用いてキャピラリー電気泳動により，15ｋV，60℃，30分間の条件で分離しました。分離された電気泳動のパターンは，GeneScan Softwareを用い，AmpFlSTR Allelic Laddersによる型判定を行いました。

結果 （画像をクリックすると拡大表示されます）

（1）

（2）

1．SNPs解析の結果

2．STR解析の結果

locus	hair	nail	saliva stain	blood stain	semen stain
D3S1358	16,16	16,16	15,16	14,18	13,15
vWA	17,17	17,17	16,18	17,18	16,18
FGA	21,26	21,26	23,24	22,25	20,23
Amelogenin	XY	XY	XY	XX	XY
TH01	7,10	7,10	6,9	7,9	6,7
TPOX	8,8	8,8	8,11	8,10	8,8
CSFIPO	11,14	11,14	9,12	8,12	12,12
D5S818	11,11	11,11	11,14	11,13	10,10
D13S317	12,14	12,14	9,9	8,12	8,10
D7S820	8,9	8,9	10,12	8,11	8,10

STRの遺伝子型
精液斑

結果に対するコメント

GenomiPhi™ DNA Amplification Kit を用いた微量な法科学的試料からの遺伝子解析(8ローカスのSNPsおよび9ローカスのSTR)が可能であり、法医実務の個人識別や犯罪捜査などへの応用が高いものと考えられました。