お客さまデータ紹介 ImageMaster 2D Platinum

【データ紹介】　1件

• 独立行政法人 海洋研究開発機構 極限環境生物圏研究センター
  李 志軍 先生、島村 繁 先生

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独立行政法人 海洋研究開発機構 極限環境生物圏研究センター
李 志軍 先生、島村 繁 先生

ImageMaster 2D Platinum のここが良い！

• ゲル間のスポットマッチングの手間が少なくなった。
• スポットの検出精度が良くなった。
• 複数のゲルイメージが同時に表示できること。

研究概要

好アルカリ性細菌は、中性菌とは異なり高アルカリ環境下での生育が可能である。好アルカリ性細菌の細胞内pHはアルカリ性環境下においても中性に維持されている。好アルカリ性細菌は極限環境に対する耐性機構として独特の細胞内pＨ調節機構を発達させたと見られる。好アルカリ性細菌の環境適応機構の全貌を明らかにするためには、変異株のみに頼った従来型の研究には限界があり、タンパク質全体の網羅的な解析が必然と考えた。

そこで、好アルカリ性細菌についてプロテオミクス手法を用い、細胞質タンパク質と膜タンパク質及び機能複合体の網羅的な比較解析を試みた。これにより、環境pHあるいは成長時期の変化がタンパク質の組成にどのような変化を起こすかを検証し、好アルカリ性に直接寄与するタンパク質とタンパク質複合体を同定し、細胞内pH維持のためにその働きがどのように調節されているのかを明らかにする。

サンプル

アルカリ性pH 10.0と中性pH 7.0のHorikoshi-II培地で対数増殖期のBacillus halodurans C-125株の菌体300～500 mg を、40 mM Tris-HCl （pH 9.5） 1.2 mlに懸濁し、フレンチプレスで破壊した後、12,000×g（4 ℃）で遠心分離を行った。上清については、一晩凍結乾燥後に8 M urea、4 % CHAPS、40 mM Tris、0.2 % Bio-Lyte 3/10を含む溶液を600 μl加え、12,000×g（20 ℃）で遠心分離後、上清を回収し可溶性画分とした。 沈殿については、 5 M urea、2 M thiourea、2 % CHAPS、2 % SB 3-10、40 mM Tris-HCl、0.2 ％ Bio-Lyte 3/10 を含む溶液を600 µl 加え、12,000×g（20 ℃）で遠心分離後、上清を回収し膜結合性画分とした。

実験方法

【一次元目等電点電気泳動】

泳動装置：	Multiphor II
一次元目のストリップ：	Immobiline™ DryStrip pH 4-7L, 24 cm
膨潤液の組成：	5 M urea、2 M thiourea、2％ CHAPS、2％ SB 3-10、0.2％ Pharmalyte™ pH3.0-10.0、0.002％ bromophenol blue （BPB）および 2 mM tributyl phosphine
泳動条件：	膨潤: 12時間 Step1: 500 V, 1 時間 Step2: 1,000 V, 1 時間 Step3: 3,500 V, 10 時間 ※電流は1 mAで制御

【二次元目電気泳動】

泳動装置：	Ettan™ DALTsix
ゲル：	20 × 24 cm
泳動条件：	Step1: 2.5 W/gel, 0.5 時間 Step2: 100 W, 5 時間

【染色】

CBB染色法（Biosafe™ CBB G-250）

【検出】

ImageScanner II*

※旧型製品です。

結果

Biosafe™ CBB G-250により染色したゲルはImageScanner IIにて検出後、その画像はImageMaster 2D Platinum でタンパク質スポットや２Dマップが持つ情報を画像解析により数値化した。約500前後のスポットをこの染色法で検出できた。その中の約10-20 ％のタンパク質の発現が環境pHの影響によって調節されたことが明らかになった。図1はB. halodurans C-125株の可溶性画分をImageMaster 2D Platinum を用いて解析を行った結果、スポットボリュームが2倍以上変化したスポットを示した。

図1. ImageMaster 2D Platinumによる解析結果

また、図2にはアルカリ条件（A）及び中性条件（B）でスポットボリュームが2倍以上に増加するものを矢印で表示した。スポットボリュームが中性条件に比べて2倍以上増加したスポットを赤い矢印（→）で、1/2以下に減少したスポットを青い矢印（→）で示した。

図2. B. Halodurans C-125 抽出タンパク質の二次元電気泳動結果
スポットボリュームが2倍以上増加したスポットを赤い矢印（→）で、1/2以下に減少したスポットを青い矢印（→）で示した。

考察

中性条件で培養した細胞より得られたスポット数はアルカリ条件で培養したものより多いことが分かった。また、環境pHによって発現量が増減したタンパク質の割合は可溶性と膜結合性タンパク質スポット全体の約20％と同程度であることが明らかになった。

Ettan™二次元電気泳動システムとImageMaster 2D Platinum 画像解析システムを用い、アルカリ誘導性タンパク質およびアルカリ性環境適応に関わるタンパク質を多数分離同定した。特に、細胞の対数期の経時的な変動を解析するために中性とアルカリ性条件下で生長した菌細胞を時間単位でサンプリングし、数多くのゲル間のスポットマッチング及びスポットの定量には大変再現性の良い結果を得られた。