組換えタンパク質の精製―応用例

ÄKTA™designシステムと高流速対応のRESOURCE™カラムを組合せて、短時間で最適な精製条件が得られます。ここではRESOURCE™ Q 1 mlを用い、流速4.8 ml/min（900 cm/h）にてpH 5～9の範囲でpHスカウティングを行い（データ一部掲載）、精製条件を至適化した後、SOURCE™ 15 Q PE 4.6/10を用いて同一サンプルを精製しました。

SDS-PAGE：

PhastGel™ Gradient 10－15

染　色：

Silver Staining Kit, Protein

レーンM：

LMW Marker Kit

レーンO：

大腸菌粗抽出液

レーン 7～12：

溶出フラクション

システム：

ÄKTA™explorer 10S

カラム：

SOURCE™ 15 Q PE 4.6/10

サンプル：

h-PCNA産生大腸菌抽出液（0.5 ml）

バッファー：

BufferPrep AIEX Mixture（pH 5.0～9.5）

溶出：

100% B=1 M NaCl

グラジエント：

20→50% B;12 CV

流速：

300 cm/h（0.8 ml/min）

フラクション：

1 ml（30% Bでスタート）

HiTrap™ Chelatingを用いた(His)₁₀-tagged proteinの精製

カラム：

HiTrap™ Chelating HP 1 ml

金属イオン：

Ni²⁺

サンプル：

(His)₁₀-tagged proteinを含む可溶化封入体

可溶化バッファー：

6 M 塩酸グアニジン、100 mM イミダゾール

結合バッファー：

6 M 塩酸グアニジン、100 mM イミダゾール

溶出バッファー：

6 M 塩酸グアニジン、500 mM イミダゾール

SDS-PAGE：

PhastGel™ Gradient 10－15

染　色：

Silver Staining Kit, Protein

レーン1、7：

LMW Marker Kit

レーン2：

細胞抽出画分

レーン3：

素通り画分

レーン4：

洗浄画分

レーン5：

溶出画分（最初の2 ml）

レーン6：

溶出画分（最後の2 ml）

ゲ　ル：

ExcelGel™ SDS Gradient 8-18

システム：

Multiphor II

レーン1、8：

LMW Marker Kit

レーン2：

クルードサンプル

レーン3：

GST融合タンパク質溶出画分
（GSTrap™ FF 1 ml使用）

レーン4：

GST融合タンパク質溶出画分
（GSTrap™ FF 5 ml使用）

レーン5：

GSTフリーの目的タンパク質溶出画分
（16 h Thrombin 処理後、
GSTrap™ FF 1 mlより溶出）

レーン6：

GST溶出画分

レーン7：

Thrombin溶液（20 U/ml＋結合バッファー）

カラム：

GSTrap™ FF 1 ml

サンプル：

GST融合タンパク質を含む大腸菌抽出物8 ml

結合バッファー：

PBS（10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄,
140 mM NaCl,2.7 mM KCl, pH 7.3）

溶出バッファー：

10 mM 還元型グルタチオン, 50 mM Tris-HCl,
pH 8.0

流　速：

1 ml/min

システム：

ÄKTA™explorer 10S