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次世代シーケンサー(NGS)サンプル調製における3つの課題

By Cytiva

次世代シーケンシングサンプル調製における一般的な課題への取り組み

次世代シークエンシング(NGS)で信頼できるデータを得ることは、DNAサンプル(またはRNA)の品質がすべてです。あなたのDNAサンプルがあなたが必要とする質の高いシークエンシング結果を与えることをどうやって確かめることができますか?

シークエンシングのためのDNAは、新鮮な組織、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織、培養細胞、液体生検など、さまざまな起源に由来する可能性があります。それぞれの情報源には、3つの重要な側面を最大化するための独自の課題があります。

  • 量(Quantity)
  • 完全性(Integrity)
  • 純度(Purity)

課題1:歩留まり(Yield)

各必要な出発原料の量は、ワークフローやキットによって異なります。ワークフローによっては、特定の種類のキットを使用する必要があるため、DNAを開始する必要があります。逆の場合も同様です。

アプリケーションに適したワークフローとキット、およびそれらが必要とする典型的な出発材料の量を理解することが重要です。両者が一致しない場合は、別の方法を試すことができますか?

サンプルが不十分であるならば、我々はシングルセルレベルで勉強している人々から何を学ぶことができますか?全ゲノム増幅(WGA)キットは、出発材料を数時間でナノグラムからマイクログラムに拡大する機会を提供します。この技術は、PCRに基づく増幅と比較して改善された適用範囲を提供し、そしてより少ない増幅エラーと関連します。

断片化方法はまたあなたの最終的なDNA収量に影響を与えるます。物理的断片化により、予想外に小さいDNA断片が失われる可能性があり、シーケンスに使用できるDNA量が減少します。あなたが選択肢を持っているならば、酵素的断片化は断片化に対するより良い予測可能性と制御を提供することができます。

課題2:完全性(Integrity)

DNAが分解された場合、十分なDNAを持っていても正確なシーケンスにはなりません。劣化はあらゆる種類のサンプルに影響を与える可能性がありますが、FFPEサンプルに見られるように、長期保存および固定液への暴露は損傷を悪化させる可能性があります。

DNA Integrity Number(DIN)測定は、DNA損傷のレベルを示すことができます。使いやすさやライブラリの複雑さなどのパラメータを完全に予測するものではありませんが、DIN測定はDNAの完全性をチェックする簡単な方法です。

もう少しDNAを抽出すると、低品質をある程度補うことができます。ただし、新しいサンプルやそのような過酷な処理を経ていないサンプルを選択できない限り、以前の保管条件についてできることはそれほど多くありません。

より良いサンプルを取得できない場合は、DNA修復によって結果が改善される可能性があります。いくつかの市販のキットは、例えば、ブロックされた3' 末端を修飾するか、またはDNAニックを固定することができます。これらの単純な修復は、より多くの断片を配列決定に適したものにするのに役立ちます。

課題3:不純物(Impurities)

さて、みなさまは十分なDNAを持っており、そしてそれはかなり良い状態です。そのチューブには他に何がありますか?

シークエンシングで信頼できる結果を得るには、タンパク質、有機溶媒、界面活性剤を含まないサンプルが必要です。考慮すべき組織固有の汚染物質もあります。

研究者は260:280 nmの吸光度比を見てDNAの純度を測定することがよくあります。高純度のサンプルは、260:280の比が1.8から2.0でなければなりません。核酸は260 nmに最大吸光度を有し、1.8 未満の比を見つけることは汚染を示すことができます。

二次的なチェックとして、フェノールやEDTAなどの一般的に使用される溶媒や界面活性剤の存在を検出する260:230の比率を測定します。2.0〜2.2の値は高純度を示します。

  • ワークフローの早い段階で赤血球を優先的に溶解して、ヘモグロビンを除去します。
  • 洗浄してヘパリンを取り除きます。
  • タンパク質の混入を減らすために、フェノール - クロロホルム抽出を行います。
  • フェノールを含まない抽出キットを使ってフェノール汚染を取り除きます。

簡単に言えば…

チャレンジ
可能な解決策
低収率
  • 他のワークフロー/キットが適切かどうか確認する
  • 全ゲノム増幅を使用する(MDAキットを使用)
  • 酵素ベースのフラグメンテーションを使用する
低い完全性
  • 全サンプルのDNA完全性を測定
  • もっとDNAを使う
  • 新鮮または新しい(FFPE)サンプルを使用する
  • DNA修復ステップを実行する
低純度
  • 測定260:280の比率(1.8〜2.0にする必要があります)
  • 組織特異的汚染物質のチェック戦略
  • フェノール - クロロホルム抽出によりタンパク質を除去
  • フェノールフリー抽出を使用

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