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次世代シークエンサー(NGS)サンプル調製の基礎

By Andrew Gane, G&Dx Solutions Strategy & Technology Manager at Cytiva

次世代シークエンシング(NGS)により、サンプルから遺伝情報をより速く、より確実に、そして今までよりも低いコストで抽出することが可能になりました。DNAをシークエンシングできるようにするには、シークエンシングライブラリーの準備と、サンプルの種類やNGSプラットフォームに応じたその他のいくつかの手順が必要です。

本記事では、NGS用にサンプルを調製するための基礎と、各ステップについての考慮事項(DNA抽出、増幅、ライブラリー調製、選択または精製、品質管理)について説明します。

次世代シークエンシング:DNA抽出プロトコル

各サンプル前処理プロトコールの最初のステップは、細胞や組織から遺伝物質(DNAやRNA)を抽出することです。RNAやタンパク質などの他の分子は、配列決定プロセスを妨げるので、他のことをする前に除去しなければなりません。特定の組織の種類と保存条件によって、この抽出プロセスの詳細が決まります。

抽出は、酵素、溶媒、または界面活性剤を用いて細胞外マトリックスを破壊し、細胞膜を開くことを伴います。得られた混合物中のDNAは次に単離されなければなりません。

DNA単離における伝統的なゴールドスタンダードはフェノールベースの抽出です。フェノールは、タンパク質を変性させて溶解し、タンパク質をDNA含有水相から除去する疎水性溶媒です。ただし、作業が面倒な場合があり、ユーザーは水相をフェノールで汚染しないように注意する必要があります。

DNAに特異的に結合するスピンカラムは代替手段を提供し、そして破片を洗い流すための使いやすいがより高価な方法です。もう1つの選択肢であるクロロホルムベースの抽出では、フェノールなしで高品質のDNAを単離することができます。市販のキットには、汚染の危険性を最小限に抑える樹脂を含めることができます。

次世代シークエンス:増幅法

アプリケーションとサンプルサイズに応じ、抽出後の増幅はオプションです。例えば、2 µgの出発物質を用いた全ゲノムシークエンシング(WGA)では、必ずしもさらに増幅する必要はありません。しかし、出発材料がナノグラム、さらにはピコグラムである場合、信頼性のあるシークエンス呼び出しを十分にカバーするには増幅が不可欠になります。

等温増幅およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、投入DNAの量を増やすための2つの一般的な方法です。PCRは、非常に均一な方法で出発材料を増幅するために一般的なプライマーを使用しますが、多重置換増幅(MDA)よりも誤りがちである傾向があります。

MDAは、等温法であり、しばしばPhi29ポリメラーゼに基づいており、そして低い割合の偽陽性および偽陰性で精度に優れています。MDAの主な欠点は、ゲノムのいくつかの領域の過剰表現です。

MALBACのようなより最近開発されたハイブリッド方法は、MDAを用いてこの問題を解決することを目的としていますが、これらの方法もまたPCRに依存し、そして同じ付随する欠点のいくつかを有します。

これらの方法の長所と短所が異なることは、それぞれが他の特徴よりもいくつかの特徴を検出するのにより適していることを意味します。例えば、このNature Reviewに記載されているように、MDAは一塩基変異(SNV)の検出において他の2つの方法よりも優れていますが、PCRとMALBACはコピー数の変動(CNV)の研究に適しています。

次世代シークエンシングのためのDNAライブラリー調製

ほとんどのNGSプラットフォームは、DNAの断片化によって作成された、一様な一口サイズの断片でDNAを分析します。このプロセスは、配列決定プラットフォームに最適である狭い長さ分布を有する断片の「ライブラリー」を生成します。

DNA断片化

機械的断片化(シャーリング)および酵素的方法の両方がNGSに適しています。機械的方法は、ランダム剪断がゲノムの任意の所与の領域について様々な重複フラグメントを生成することを可能にします。これはde novoアセンブリにとって理想的です。

酵素的方法は比較的速くそして前もって投資を少なくする必要がありますが、いくつかの部位を優先的に開裂し、多様な重複フラグメントなしに新規の組み立てをより困難にし、いくらかの「偏り」を有します。

DNA末端修復

生成された断片は、一本鎖の「粘着性」末端を有します。次のステップである末端修復は、これらの粘着末端を埋めて平滑末端を作り出し、アダプター連結の準備が整います。

アダプター

次いでアダプターをライブラリーフラグメントの5' 末端および3' 末端の両方に結合させます。これらはシークエンシングプラットフォームに固有のものですが、最終的にはすべて、プラットフォーム内クローナル増幅、つまりイルミナのブリッジ増幅またはBGIのローリングサークル増幅を可能にするように機能します。

アダプターは、パターン化フローセルなどのシーケンサー特異的基質に結合するように設計されており、増幅を可能にするための配列を含み、そしてフラグメント同定のためのバーコードを有することができます。

ターゲットシークエンス

これらのライブラリー調製工程は一般に全ゲノム配列決定に適用可能です。ターゲットシークエンスを実行しようとしている場合は、ライブラリの準備は異なります。

アンプリコンに基づく標的濃縮において、断片化および末端修復工程は不要である傾向があります。平滑末端を持つアンプリコンフラグメントとして標的領域を引き出すと、直接アダプターライゲーションに進むことができます。

ハイブリダイゼーションに基づく濃縮は断片化を必要とします。ハイブリダイゼーションプローブは、末端修復の準備が整った、重なり合うフラグメントのライブラリーから目的の領域を引き出します。

DNA配列決定:サイズ選択および精製

ワークフローをスピードアップするには、シークエンスの前に、関連データを生成しないフラグメントを削除してライブラリを「クリーンアップ」する必要があります。サイズ要件が狭いNGSワークフローでは、有用な結果を得るには大きすぎるまたは小さすぎるフラグメントを破棄すると、シークエンスの効率が向上します。

サイズ選択にはさまざまなプロトコルがあり、ゲル電気泳動または磁気ビーズベースの選択が含まれる場合があります。磁気ビーズは、最終的なクリーンアップのための迅速で簡単な方法も提供します。

DNA品質管理

シークエンシングに進む前の最後のステップは、DNAの品質と量を確認することです。どちらのパラメーターもシーケンスデータの信頼性に寄与します。蛍光またはqPCRベースの方法を使用してDNAの量を測定できます。

定性的検証のために、多くのプロトコルはAgilent TapeStation™ またはBioanalyzer™ を使用します。品質または量の問題に対する可能な解決策のためのNGSサンプル調製における課題についての私達のブログを見てください。

これらは、研究者が塩基配列決定用のDNAを調製するために使用する基本的なステップです。特定のNGSワークフローとアプリケーションに関する詳細は、他のNGSブログにあります。

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