細胞表面受容体の弱く速い認識を解析する

齊藤貴士1　黒木喜美子2　福原秀雄2　前仲勝実1, 2
1北海道大学大学院薬学研究院創薬科学研究教育センター
2北海道大学大学院薬学研究院生体分子機能学研究室

はじめに

細胞表面の受容体とそのリガンドとなるタンパク質や糖の相互作用は、細胞の活性を制御する最初のステップであり、生体の恒常性維もにおいて重要な役割を担っています。この細胞表面受容体群によるリガンドの認識では、受容体はそれぞれのリガンドに対し適切な特異性と親和性をもっています。そして一度このバランスが崩れると、疾患の発症につながるケースが多数存在します。さらに細胞表面受容体は外界との接点であることから、微生物やウイルス由来の分子に受容体として利用されることもあります。細胞表面受容体とリガンドとの相互作用について、構造生物学的手法などから得られる情報を利用し、細胞表面受容体をターゲットとする低分子化合物あるいは抗体をはじめとするタンパク質医薬品を開発できれば、特異性の高い疾患制御が可能な薬剤開発に結びつく可能性を秘めています。
今回は、これらの細胞表面受容体について、そのリガンド認識の特徴を、表面プラズモン共鳴法および等温滴定型カロリメトリーによる物理化学的側面から捉え、我々の例を中心に解説します。特に、細胞表面受容体―リガンド認識は一般的に弱く速い認識であることが多く、その解析には各ステップでのボトルネックが存在するため、これらについて概説します。さらに、相互作用解析を利用して、リガンド結合部位の同定や複合体モデル構築に利用できる例をとり上げます。

 

細胞表面受容体のタンパク質調製

はじめに、細胞表面受容体を解析するには多くの場合、リガンドと直接結合する細胞外ドメインを抜き出して（膜貫通部位を削除して）、可溶型として発現させます。細胞表面に発現するタンパク質の多くは糖鎖修飾等の翻訳後修飾を受け、ジスルフィド結合を形成します。このため、もっとも広く用いられている大腸菌発現系では、翻訳後修飾が行われないことや、細胞内が還元状態であるためジスルフィド結合が形成されないことなどの理由で、機能的なタンパク質として大量発現できないケースが多くあります。我々はこれらを解消するために、糖鎖修飾が必須でない場合、大腸菌を用いて封入体の状態で発現させた後、正しくジスルフィド結合を形成した機能的な立体構造をとるように、巻き戻し系の確立を進めています。他方、糖鎖修飾を積極的に行うヒト培養細胞あるいは昆虫細胞を用いた発現系も構築しています。少し話がずれますが、X線結晶構造解析に適する結晶を得るために、N―グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を改変したヒトHEK293GnTI-細胞を用いることにより、糖鎖修飾の不均一性を抑え、均一なオリゴマンノース修飾組換えタンパク質を調製することが可能です。我々は上述の巻き戻し系とヒトHEK293GnTI-細胞発現系を基本的な発現系と位置づけてタンパク質調製を行っています（さらにカイコ個体を用いた発現系も利用するケースがあります）（図1）。

 

　大腸菌発現系
　・積極的に封入体として大量発現
　・リフォールディング（希釈法）
　培養細胞HEK293S GnTI－発現系
　・培養液への分泌による精製の単純化
　・N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼⅠ
　　変異による均一な糖鎖修飾（オリゴマンノース型）
　バキュロウイルス-昆虫細胞／カイコ発現系
　・N結合型糖鎖のほとんどがトリマンノシルコア型
図1. 当研究室で用いている各種組換えタンパク質大量発現系

 

相互作用解析の実例ーLILRファミリー

LILR（leukocyte immunoglobulin （Ig）-like receptor）ファミリーは1997年以降、相次いで同定されたヒト免疫細胞表面受容体群で、11個の受容体が存在します。細胞外ドメインは10 kDa程度のIg様ドメインがタンデムに2個もしくは4個連なった構造をとります。今回、とり上げるLILRB1とLILRB2は、細胞外に4つのIg様ドメインをもち、膜遠位の2つのドメイン（D1D2）を用いてリガンドMajor histocompatibility complexクラスI （MHCI、主要組織適合性抗原） を広く認識することによって、免疫細胞の抑制性シグナル伝達に関与します（図2）。

 

A．左：LILRB1およびLILRB2の分子構造。ともに細胞外に4つのIg様ドメイン、細胞内に4つもしくは3つのITIMをもちます。右：LILRB1（1G0X）とLILRB2（2GW5）のX線結晶構造。それぞれ右図ドメイン構造の膜遠位D1D2ドメイン構造であり、いずれもIg様ドメインが鋭角に曲がった構造をとっています。


B.　LILRB1およびLILRB2のシグナル伝達図。cisまたはtransに細胞表面上のMHCIと結合し、細胞内にITIMを介した抑制シグナルを伝達することにより、正常細胞に対する自己寛容を誘導する一方で、異常細胞上のMHCI発現量低下を感知し、シグナル抑制を解除します。

図2. LILRB1、LILRB2のドメイン構造およびシグナル伝達

 

一方、リガンドとなるMHCI分子は、ヒトではHuman leukocyte antigen（HLA、ヒト白血球抗原）クラスIとよばれます。その構造は細胞外領域が3個のドメイン（α1, α2，α3）で形成される分子量約30 kDaの重鎖と、12 kDaのβ2ミクログロブリン（β2m）軽鎖、そして8～10残基程度のペプチドで形成されるヘテロ三量体です*1（図3A、B）。

*1 重鎖のα1, α2ドメインが形成するαヘリックスの溝に自己もしくはウイルス由来のペプチドが入り、これをCD8陽性T細胞に提示することで、自己・非自己の認識に関与しています。このα1, α2ドメインの著しい多型性により、MHCIは莫大な数の自己・非自己ペプチドを提示できます。

 

A.　LILRB1（緑）とHLA-A2のα1, α2, α3ドメイン、ペプチド（青）とβ2m（黄）複合体のX線結晶構造（PDB ID: 1P7Q）。
B.　LILRB2（シアン）とHLA-Gのα1, α2, α3ドメイン、ペプチド（赤）とβ2m（黄）複合体のX線結晶構造（PDB ID: 2DYP）。


C.　HLA-A2/LILRB1とHLA-G/LILRB2の複合体構造の重ね合わせ。LILRB1（青）に比べ、LILRB2（赤）はMHCIのα3ドメインに寄って結合しています。MHCIを分子表面モデル、LILRBをリボンモデルで示しました。

図3

 

以下にLILRB1とLILRB2、そしてMHCIの相互作用に焦点をあて、X線結晶構造解析と表面プラズモン共鳴（SPR）、そして等温滴定型カロリメトリー（ITC）による解析を組み合わせた研究例について報告します。
LILRB1とLILRB2のリガンドに対する親和性の違いについて、SPRの原理を利用した相互作用解析装置Biacore™を用いて解析を行いました[1]。実験に用いたLILRB1-D1D2とLILRB2-D1D2、およびMHCIの組換えタンパク質は、大腸菌発現系で封入体を得た後、巻き戻しにより可溶性タンパク質として調製しました。MHCIはC末端にビオチン化タグを導入し、ストレプトアビジンを直接固定化したCM5チップ上に固定化しました。これによりチップ表面に固定化する際に相互作用に重要な表面が隠れてしまうことなく、細胞表面の分子配向性を再現させることで、活性なMHCIを効率よく集積させることに成功しました（最近Biotin CAPture Kitが販売され、同じチップでビオチン化サンプルの固定化を相当数繰り返し使用できるため、大幅なコストダウンが可能です）。ここにアナライトとしてLILRB1, LILRB2の可溶性分子を流すことで、数種類のMHCIタンパク質との相互作用を網羅的に解析しました（表1、図4）。

 

表1 Biacore™によるLILRB1とLILRB2のMHCIに対する解離定数の解析

MHCI	解離定数KD（μM）
	LILRB1	LILRB2
HLA-A11	ND	45 ± 17
HLA-B35	8.8 ± 0.2	26 ± 5
HLA-Cw4	6.5 ± 0.5	14 ± 2
HLA-G	2.0 ± 0.7	4.8 ± 1.4

それぞれのMHCIの固定化量は 800 - 3,000 RU。 25℃で測定。

 

左：LILRB2および右：LILRB1の濃度を横軸に、レスポンスカーブが平衡状態に達した時のレスポンス量を縦軸にプロットしました。ともに1：1 の結合モデル曲線にフィットし、さらにスキャッチャードプロットでも直線によくフィットしました。

図4 平衡結合解析による固定化MHCIに対するLILRB1、LILRB2の解離定数（KD値）

 

この結果、LILRB1, LILRB2ともにMHCIに対し解離定数（KD）が10-5 ～ 10-6 Mのオーダーであり、一般的な免疫細胞表面受容体の親和性と同程度であることがわかりました（表1）。また、LILRB1の方が、全体的に親和性が高いことが明らかになりました。この解析では、結合および解離速度がBiacore™の時分解能（0.2 sec）の限界に近く、測定にはhigh resolution modeでかつ1レーンずつ測定する必要があります。さらに、結合が弱いために、LILR分子を高濃度で流さなければならず、適切な測定を妨げるアグリゲーションに注意しなければなりません。測定直前に遠心して上清のみを使用することでは不十分な場合もあり、その場合は、測定直前にゲルろ過クロマトグラフィーを行い、目的分子量にあたるフラクションをそのまま用いて測定することでアグリゲーションを回避できることもあります。
また、当初MHCIの固定化には、化学的にビオチン化したβ2mと共にMHCIを巻き戻し、ビオチン化β2mを介してMHCIの固定化を行っていました。しかし、LILRB2はMHCIに結合するものの、LILRB1は全く結合しないという興味深い結果を得ました。このこと実を基に、我々は先のように固定化法を変更し、より生理的条件に近い条件を再現することでLILRB1についてもMHCIに対する結合を確認することができました。また、このこと実はより詳細にLILRファミリーのMHCI特異性を調べるきっかけとなり、特殊な形態であるβ2m欠損型に対する結合様式の差異を見いだすことができました。すなわち、LILRB2はβ2m欠損型MHCIを認識しますが、LILRB1は結合しません。最近、β2m欠損型MHCIが生理的意義のある分子形態であるとの報告が増えてきていることから、LILRB1、LILRB2の結合特異性の違いが重要な免疫制御に関わっている可能性が高く、重要な知見であります。また、続いて我々は、LILRB2とHLA-Gとの複合体の結晶構造解析を行い[2]、LILRB1/HLA-A2複合体と比較したところ、両者は相対的な認識機構は似ているものの、LILRB2はLILRB1よりもα3ドメイン優位に、LILRB1はβ2m優位に認識していることが示されました（図3）。Biacore™測定で得られたLILRB1とLILRB2のMHCIに対する親和性の差は、この認識の違いに基づくものと考えられます。
次に、LILRBと同様にMHCIのα3ドメインを認識し、T細胞の活性化に重要なCD8とLILRBのMHCIに対する競合の有無について、Biacore™を用いて解析を行いました1）。十分量のCD8存在下および非存在下でHLA-Gに対するLILRB1とLILRB2の結合実験を行った結果、LILRBの濃度に依存してHLA-GへのCD8の結合量が減少していることがわかりました（図5）。

 

LILRB1 （A） とB. LILRB2 （B） の単独（●）とCD8存在下（■）のMHCIに対する結合レスポンス。×はCD8存在下・非存在下のレスポンスの差をプロットしたものです。
B． CD8およびLILRB1/LILRB2はともにMHCIのα3ドメインを認識するため、お互いに競合します。LILRB1はCD8に比べMHCIに対する結合が早く、解離が遅いため、正常細胞に対する細胞活性化の閾値を下げる役割を担っています。

図5 MHCIに対するLILRB1、B2とCD8の競合結合性。

 

これは、HLA-G上でCD8に対しLILRB1とLILRB2の結合が競合していることを意味しています。そして、速度論的解析ではLILRB1/MHCI相互作用は免疫系受容体の中でもとりわけ早い結合、解離速度をもつことがわかりました （ka = 5.0 ～ 9.2 × 105 M-1 s-1, kd = 2.1 ～5.0 s-1）[3]（表2）。

 

表2 Biacore™によるMHCIに対するLILRB1、LILRB2および細胞表面受容体の速度論的パラメーター

		ka （× 105M-1s-1）	kd （s-1）	KD （μM）
LILRB1	HLA-G1	9.2	2.1	2.4
LILRB1	HLA-B35	5.0	3.7	7.4
LILRB1	HLA-Cw4	6.3	5.0	8.1
LILRB1	UL18	1.4	0.0028	0.0021
KIR2DL3	HLA-Cw7/DS11	2.1	1.1	5.2
CD8αα	MHC class I	≥ 1.0	≥ 18	~ 200
PILRα	CD99	3.9	1.2	3.0
CD22	CD45	≥ 1.5	≥ 18	117
CD80	CTLA-4	9.4	0.43	0.46
CD80	CD28	6.6	1.6	2.4
FcgRIIa,IIb,III	hFc1	3.8-4.4	0.31-0.69	0.72-1.9
TCR	MHC/peptide	0.009-0.2	0.01-0.1	1-90
E-selectin	ESL-1	0.48	2.7	56
L-selectin	GlyCAM-1	> 1	> 10	108
P-selectin	PSGL-1	44	1.4	0.32

 

この値はMHCI分子上の結合領域が競合するCD8 （ka = 1.0 × 105 M-1 s-1, kd > 18 s-1）よりも結合速度が速く、解離速度が遅いことを示します。これらの結果から、LILRBはCD8がMHCIに結合するのを阻害することで、T細胞活性化シグナル伝達の始動を制御する、すなわちT細胞が活性化される際の閾値を上げる役割ももつことが示唆されました。このようにかなり弱い結合同士の競合実験も行うことができる点は重要であり、また速度論的な側面を比較することで生理的な意義に迫ることができる点もBiacore™を用いて解析するメリットと言えます。

さらに、LILRB1とMHCIの相互作用についてBiacore™とITC を用いた熱力学的解析を行いました[3]。Biacore™を用いた解析では、各温度に対するKDのプロットから、熱容量ΔC_pの項を考慮した非線形van't Hoffの式を用いてフィッティングを行いました。一方、ITCを用いた解析はセル中のMHCIに対しLILRB1を滴定することで測定しました。その結果、両手法で決定した熱力学的パラメーターはほぼ一致するものであり、大きな差異は見られませんでした（表2）。

LILRB1によるMHCIの認識はエントロピー駆動型の相互作用であり、比熱の変化量が小さい （-0.10 ～ -0.22 kcal mol-1 K-1）ことから、結合時に大きな構造変化は起きていないと予想されました。これまでT細胞受容体やKiller cell Ig-like receptorなどの細胞表面受容体に関してリガンドとの相互作用解析が行われてきましたが、完全なエントロピー駆動型の相互作用はLILRB1が初めてでした（表3）。

ここで、エントロピー駆動型の認識とはどのようなものかを立体構造の側面から検証します。LILRB1のリガンド認識に関与するD1D2の立体構造は複数の状態で構造決定されています[3], [4], [5]。

その結果、2つの逆平行βシートで形成されるD1とD2が疎水性相互作用により鋭角に連なった構造をとりますが（図2）、LILRB1のドメイン間には可動性が存在することが明らかとなりました。また、NMRを用いてLILRB1のMHCI結合に伴う構造変化を検証すると、やはりドメイン間の可動性を示唆する結果を得ました[3]。

上述のようなLILRB1の熱力学的なパラメーター（エントロピー駆動型でかつ小さな負の熱容量）は、結合による構造変化があまりないことを示しますが、ドメイン間の可動性と矛盾します。他方、エントロピー駆動に寄与するLILRB1-MHCI間の疎水性相互作用は一般的な結合に比べ、決して多いものでなく、これで説明することもできません。そこで、我々は複合体形成後もLILRB1は十分にD1D2ドメイン間の可動性が残り、揺らいだ認識モードが存在すると考えています。これは速度論的に速い認識をも説明できるモデルです。

このように熱力学的側面を調べることで、その分子認識がより明らかになります。上述のような比較的弱い結合（サブμMオーダー以下）は、サンプル量が多く必要である点や高濃度にしなければいけない点など解析には難しい点があり、まだ十分なデータが蓄積されておらず、今後のデータベースの充実が期待されます。また、van't Hoffのモデルにより決定したパラメーターと直接熱量を測定したパラメーターが一致しないことを指摘する論文がありますが、我々の研究対象である比較的弱い結合で、かつ速度論的に速い認識に関しては、かなり一致するようです。この点もデータの蓄積によりその本質が明らかとなってくることが期待されます。

 

表3 Biacore™によるMHCIに対するLILRB1および細胞表面受容体群の熱力学的パラメーター

analyte	ligand	ΔG	ΔH	-TΔS	ΔCp
		（kcal/mol）	（kcal/mol）	（kcal/mol）	（kcal/mol･K）
LILRB1	HLA-G1	-7.5	1.9	-9.4	-0.22
LILRB1	HLA-B35	-6.6	0.6	-7.2	-0.10
LILRB1	HLA-Cw4	6.3		-6.6	-0.16
KIR2DL3	HLA-Cw7/DS11	-7.2	-4.1	-3.1	-0.1
NKG2D	RaeI	-8.6	-5.2	-3.4
NKG2D	H60	-10.5	-23.6	13.1
PILRα	CD99	3.9	1.2	3.0
CD22	CD45	-5.1	-10.1	5.0	-0.08
FcRγRIIa,IIb	hFc1	-7.9 to -8.3	-4.4 to -6.4	-1.9 to -3.3	-0.22 to -0.43
FcRγRIII	hFc1	-8.0	-15.4	7.4	-0.7
TCR	MHC/peptide	-7.1	-14.6	7.1	-0.62
E-selectin	ESL-1	-5.7	-0.9	-4.8

ΔG：ギブスエネルギー変化、 ΔH：エンタルピー変化, -TΔS：エントロピー変化, ΔCp：比熱変化

 

References

1. Shiroishi, M. et al. （2003） Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 100, 8856-8861
2. Shiroishi, M. et al. （2006） Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 103, 16412-16417
3. Shiroishi, M. et al. （2006） J. Mol. Biol., 355, 237-248
4. Chapman, T. L. et al. （1999） Immunity, 13, 727-736
5. Willcox, B. E. et al. （2003） Nat. Immunol., 4, 913-919

 

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