オーファン・セラピー（希少疾病治療薬）の市場投入を加速

オーファン・セラピーの人口は少ないですが、希少疾患の治療法を利用できるようになることは、罹患している患者さんにとって大きなインパクトがあります。前臨床試験や臨床試験のためのプロセス開発や製造において、能力や専門性を高めるための協力は、市場投入までの時間を短縮するための一つの方法です。このケーススタディでは、毒性試験用の材料をcGMPで製造するプロセスの開発を加速するために、CytivaのFast Trak™ Servicesチームが行った作業を紹介します。Fast Trak™チームとお客様の間で頻繁にコミュニケーションをとることで、お客様の知的財産を保護しながら透明性を確保しました。Cytivaの科学者はRoivant Sciences社と密接に協力して技術移転を進め、cGMP製造プロセスが開発されました。その結果、毒物学研究のために400gのRVT 801が製造されました。

背景

酸性セラミダーゼは、ASAH1遺伝子にコードされており、この遺伝子が2つ変異するとファーバー病になります。このような稀な疾患を対象とするバイオテック企業であるRoivant Sciences社は、酵素補充療法として組換えヒト酸セラミダーゼ（rhAC）を提案しています。前臨床モデルでは、細胞にrhACが取り込まれ、リソソームに蓄積されたセラミドが分解されます。rhACによる酵素補充療法は、結果が保証されていない毒性のリスクを伴う骨髄移植よりも優れた選択肢となることが期待されています。Roivant Sciences社は、バイオマニュファクチャリングにおけるリスクを軽減し、市場投入までの時間を短縮するために、Cytiva Fast Trak™ Services社と共同でrhACの製造プロセスを開発しました。このプロジェクトの目標は、毒性試験に十分な材料を提供できるcGMP製造プロセスを開発することでした。製造性を向上させるために、中空糸型バイオリアクターシステムでrhACを製造し、Con A Sepharose™ affinity、Blue Sepharose™ affinity、Superose™サイズ排除クロマトグラフィーレジンを用いた3段階のクロマトグラフィープロセスで精製していた元のプロセスから、新たなプロセスを開発しました。Cytivaのプロセスでは、単回使用のXcellerex™撹拌槽バイオリアクターシステムでの上流生産と、最新のCapto™ S ImpAct陽イオン交換、Capto™ Butyl疎水性相互作用、Capto™ Q陰イオン交換クロマトグラフィーレジンを用いた3つの連続したステップでの下流精製が行われました。

ベストパフォーマンスのクローンの選択

クローンの選択は、125mLのシェイクフラスコ培養で行いました。rhACを発現する3つの異なるチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞クローン（47、09、77）を、SDS PAGE分析で求めた生存細胞密度と細胞生産性に基づいてスクリーニングしました。細胞は、BalanCD™ CHO Grow A基本培地（Irvine Scientific社）に5.0% HyClone™ Cell Boost™ 7aおよび0.5% Cell Boost™ 7bを添加したものを用いて、所定のスケジュールで培養しました。最も成績の良かったクローン（47）については、セルブースト7aと7bの供給比率を4.0%/0.4%として培養を繰り返しました。培養は37℃で120rpmの撹拌速度で12日間行いました。その結果をFig 1に示します。

Fig 1. （A）培養期間中の生存細胞密度、（B）シェイクフラスコ培養における試験クローンの12日目の細胞生産性。

プロセスパフォーマンスの最適化

選択したクローン（47）の給餌条件の最適化を、125mLのシェイクフラスコ培養で行いました。BalanCD™ CHO Grow Aを基本培地とし、以下の給餌バッチ条件を評価しました：

培養は37℃（条件5の場合は4日目に温度を変更）、120rpmの撹拌速度で12日間行いました。サンプリングスケジュールに従って、生細胞密度と細胞生産性を分析し、最適な供給バッチ条件を決定しました。培養期間中、アンモニウムレベルをモニターしました。その結果を Fig 2 に示します。条件 5 と他の条件を分ける特異な変数は、4 日目の温度低下です。条件5は代謝速度が遅いため、他の条件よりもグルタミンの消費量が少なく、そのためアンモニウム濃度が低くなり、これが条件5の生存細胞密度の長期化に寄与したと考えられます。条件5では、培養後の生細胞密度が向上したことに加え、rhACの力価も大幅に向上しました。条件5のCell Boost™ 7aおよび7bでは、ピーク時の生細胞密度が3×10⁷ viable cells/mLとなり、最高のパフォーマンスが得られました。

Fig 2. （A）培養期間中の生存細胞密度、（B）12日目の細胞生産性、（C）選択したクローン（47）のシェイクフラスコ培養でのアンモニウム濃度。

Xcellerex™ XDR 10バイオリアクターシステムを用いて、Cell Boost™ 7aと0.5% Cell Boost™ 7bを使用しました。プロセス条件をTable 1に示します。培養期間中にモニターしたパラメータは生細胞密度、細胞生産性、培養pH、CO2分圧（pCO2）、グルコース、アンモニウム、グルタミンの濃度です。細胞の成長と生産性をFig 3に示します。最良の結果が得られたのは 0.5 mm の穴を開けた場合よりも高い物質移動量（kL a）が得られる 20 µm のスパージ構成でした。細胞がせん断力に対して低い感度を示したため力価を高めるために実行の最後に撹拌を増加させることができました。

Table 1. バイオリアクターの培養パラメータを最適化するためのプロセス条件

Parameter	Run 1	Run 2	Run 3
Starting volume	7.5 L	7.5 L	7.5 L
Temperature	37°C with a temperature shift on Day 4	37°C with a temperature shift on Day 4	37°C with a temperature shift on Day 4
Dissolved oxygen	40%	40%	40%
pH	7	7	7
Agitation rate	At 7.5 L:100 rpm	At 7.5 L:100 rpm	At 7.5 L:100 rpm
	At 10 L:100 rpm	At 10 L:100 rpm	At 10 L:100 rpm
Sparge porosity	20 μm	0.5 mm drilled hole	20 μm
Air sparge high limit	0.05 sL/mim	0.05 sL/mim	0.05 sL/mim

Fig 3. XDR-10バイオリアクターシステムで培養した選択したクローン（47）の培養期間中の（A）生存細胞密度および（B）細胞生産性

小規模なcGMP生産：10 L スケールの Run 3 のバイオリアクターパラメータを使用し、XDR 200 バイオリアクターシステムを用いてプロセスを 200 L にスケールアップしました。スケール間の同等性を示すため、生細胞密度、細胞生産性、培養pHとpCO2、グルコース、アンモニウム、グルタミンの濃度について XDR 10バイオリアクターの実行結果と比較しました。2回のエンジニアリングラン（XDR 10 および XDR 200）と 2回の cGMP ラン（XDR 200）の細胞成長と生産性をFig 4 に示します。

Fig 4. XDR-10およびXDR-200バイオリアクターシステムで培養した選択したクローン（47）の培養期間中の（A）生存細胞密度および（B）細胞生産性

ダウンストリーム精製と最終製剤

製造性、純度、回収率を向上させるため、Con A Sepharose™ affinity、Blue Sepharose™ affinity、Superose™サイズ排除クロマトグラフィーを用いた当初のアカデミックラボスケールのプロセスからrhACの下流精製を最適化しました(1)。また、開発した下流工程は、200Lのトキシコロジーランを実施できるように、拡張性と堅牢性を備えていることも重要でした。

Table 2.rhACの下流精製の結果（NA=該当なし；ND=検出なし）

Process step	Volume	Concentration	Total rhAC	Step recovery	Purity
Bioreactor day 12	201.0 L	3.89 mg/mL	782.0 g	NA	ND
Harvest clarification (depth filtration)	537.0 L	1.03 mg/mL	553.5 g	70.80%	-85%
Capture (Capto™ S impAct eluate)	135.2 L	3.16 mg/mL	427.2 g	76.40%	95%
Intermediate polishing (Capto™ Butyl eluate)	179.1 L	1.90 mg/mL	340.3 g	79.60%	99%
Final polishing (Capto™ Q flow-through)	191.0 L	1.74 mg/mL	332.3 g	97.70%	>99%
Viral filtration	198.0 L	1.70 mg/mL	336.6 g	101.30%	NA
Ultrafiltration (M, 10 000 NMWC)	28.4 L	11.00 mg/mL	312.4 g	92.80%	NA

最適化されたプロセスは以下のステップで構成されています：

最終製品は、Roivantチームと合意した処方の目標濃度に達するように、公称分子量カットオフ（NMWC）が10,000のフィルターを用いて限外濾過で濃縮しました。結果をTable 2に示します。プロセス全体の回収率は、SDS PAGE分析による純度99％で、280nmの分光光度で測定したところ44％でした。宿主細胞のDNAは、初期の33×10⁶ng/Lからプロセス中に<6.0ng/Lまで減少しました。

プロセス概要と技術移転

rhACの生産量を最大化するために、最も高い細胞増殖率と生産性を示したCHO細胞クローンを選択し、上流の培養条件を最適化しました。最適化された上流工程は、125mLのシェイクフラスコから10Lおよび200Lのバイオリアクターへとスケールアップすることに成功しました。下流工程の製造性、純度、回収率を向上させるために、深層ろ過による清澄化と3回の連続したクロマトグラフィーでの精製からなる精製工程を開発しました。このプロセスを用いて、200LのプロセスでrhACをcGMPに従って製造し、毒性試験に十分な材料を得ることができました。プロジェクト終了後、設定されたスケジュールに沿って最終報告書が提出され、技術移転に必要な書類がFast Trak™ サービスチームによって作成されました。

結論

rhACを用いた酵素補充療法は、患者さんの治療のために迅速に市場に投入する必要性が指摘されているオーファン療法です。このケーススタディでは、Roivant Sciences社とCytiva Fast Trak™サービスチームとのコラボレーションにより、rhACを製造するためのプロセスの開発と最適化を行いました。このプロジェクトは、Roivant社のリスクとコストの負担を軽減し、市場投入までの時間を短縮するのに役立ちました。クローンの選択、上流の製造プロセスと下流の精製プロセスの最適化により、毒物学研究に使用するための十分な量の製品をcGMPに準拠して製造することができました。技術移転は困難な場合があるため、Fast Trak™の科学者たちは、このプロセスを促進するためにRoivant社のチームと密接に協力しました。

感謝の気持ちを込めて

Roivant Sciences社には、Fast Trak™サービスのデモンストレーションとして、この作品の使用許可を快く提供していただきました。「Roivant社は、Cytiva チームがRVT 801を自分たちのプログラムのようにこのプロジェクトに取り組んでくれたことを非常に高く評価しています。Cytiva チームは、RVT 801を自分たちのプログラムのようにこのプロジェクトに取り組んだことを非常に高く評価しています。彼らはファーバーの患者さんの必要性を認識し、毒性試験を成功させ、臨床試験を開始する準備をしています。誰もが患者に焦点を当てており、この関係がうまくいったのはそのためです。" - Alex Tracy (Vice President of Pharmaceutical Development, Roivant Sciences) 参考文献1. He X. et al. Purification and characterization of recombinant, human acid ceramidase. jbc 278, 32978-32986 (2003).