スケーラブルなシングルユースmAb精製のためのFibro PrismAの評価

By Ryan Zolyomi, Ian Scanlon*, Florence Rusly, Oliver Hardick*, Ashley Hesslein, and Hendri Tjandra.
Biological Development – Isolation & Purification, Bayer U.S. LLC, Pharmaceuticals and Cytiva*

モノクローナル抗体（mAb）の臨床製造では、プロテインAのクロマトグラフィーレジンへの捕捉により、優れた回収率と純度が得られます。しかし、臨床ではバッチサイズが小さいため、本格的な製造に比べて必要なサイクル数が少なく、レジンの寿命が十分に発揮されないという問題がありました。BayerはCytiva社と協力して、ファイバーベースの代替品であるFibro PrismAを評価し、真のシングルユースmAb捕捉技術としての可能性を検討しました。研究室規模からプロセス規模のユニットまでのスケーラビリティを評価し、複数のサイクルにおける圧力損失、ステップリカバリー、純度、溶出液量を追跡しました。

プロテインA レジンベースのプロセスと比較して、Fibor クロマトグラフィーの初期のプロセスモデルでは、バッファーの消費量と溶出液の量がやや多いものの、生産性が大幅に向上することが示されました。これらの量は、設備に合わせて必要であれば、最適化によってさらに少なくすることができます。このように、Fibro PrismAの実用性は製品化に適しています。

既存プラットフォームへの適合性評価

現在のmAbプラットフォーム・プロセスでは、クロマトグラフィーレジンが、キャンペーン間の切り替えを簡単かつ迅速に行うことができる完全なシングルユース・プロセスを実現するための主要な障壁となっています。また、このようなプロセスは、複数の製品を製造する施設での運用に柔軟性をもたらします。このような観点から、Cytiva社のFibro PrismAを用いたキャプチャーステップの評価が行われました。ファイブロークロマトグラフィーは、セルロースファイバーの明確なマトリックスを使用しており、クロマトグラフィービーズや膜吸着剤に比べて非常にオープンな構造を持っています。この独自の構造により、この技術は、充填床クロマトグラフィーによる精製の拡散や流れの制限、および膜吸着装置の容量の問題を克服することができます（Fig 1参照）。

Fig 1. 異なるクロマトグラフィーベースマトリックスの表面積と物質移動のメカニズム。

Fibro技術で考慮すべき点の1つは、1日の稼働時間内に可能なサイクル数の多さで、これによりFibroユニットの全寿命を1回のバッチで実現することができます。特に、製品の入れ替えや小ロットが必要な場合には、カラムの充填、洗浄の検証、保管などが不要になるため、臨床および商業生産におけるシングルユース・クロマトグラフィーの効率が大幅に向上します。

我々は、標準的なスケールアップパラメータを用いて、ベンチスケールからプロセススケールまで、異なるサイズのFibro PrismAユニットの寿命とスケーラビリティを評価する一連の実験を計画しました。開発したプラットフォームプロセスをFig 2に示します。ラボでの実験では、CVを減らし、カラム再生のステップを省くことで、Fibro PrismAのサイクル時間を最適化できることが実証されました。また、Fibro PrismAの流速は、一般的なプロテインA レジンを用いたプロセスよりも大幅に速いです。流速は、Fibro装置の流速の制約ではなく、システムのハードウェア（クロマトグラフィースキッドなど）によって制限されることがあります。Fibroユニットでは、1回のクロマトグラフィーを比較的短時間で完了することができるため、同量のロードマテリアルを精製するためにユニットを迅速に循環させることができます。

Fig 2. 上）プロテインA レジンベースのプロセスとCytiva社のMabSelect SuRe™ LX、（下）Fibro PrismAプロセスを用いたmAbプラットフォーム精製の比較。

清澄化された細胞培養液（CCCF）500Lを、Table 1に記載のそれぞれのランに分配しました。

Table 1. Fibro PrismAのベンチからプロセススケールまでの評価

清澄化された収穫物は、Fibro PrismAユニットに投入される前にさらに濾過されています。我々の研究では、この追加ろ過により、ユニットの汚れや複数サイクルに渡る圧力上昇を最小限に抑えることができ、Fibroユニットの寿命が最大で40％延びることが示されました（Fig 3参照）。レジンベースのプロセスでライフタイムスタディを行うには膨大な時間とリソースが必要ですが、Fibro PrismAユニットの両方のフィードストリームでライフタイムスタディを行うには24時間もかかりませんでした。ろ過工程を追加することで、サイクル中の圧力上昇が大幅に抑えられ、ユニットの寿命が劇的に延びることがすぐに分かりました。

Fig 3. Fibro PrismAユニットのロード前にろ過をした場合としない場合のサイクル試験。

本研究では，160mLのPilotユニットと2.4LのProcessユニットのシングルユーススキッドを評価しました。これらのユニットサイズは、それぞれ50-200Lおよび500-2000Lのバイオリアクタースケールに適しています。サイクルタイムは、シングルユースのクロマトグラフィーシステムの圧力制限により決定されました。プロセスユニットは、シングルユースの「ÄKTA ready™ High Flow Kit」の最大流量で運転しました。両ユニットのデルタ圧力は、サイクル中にわずかに上昇しましたが、許容範囲内でした（Fig 4参照）。

A)

B)

Fig 4. Fibro PrismA (A) 160 mL Pilotユニット、および (B) 2.4 L ProcessユニットにおけるUV 280および圧力（DeltaC圧力）のオーバーレイ（サイクル間）。

Evaluating scalability and product quality

処理中に、スケール間で溶出液の溜まり方が均一にならないという問題が発生しました。これらの問題は、タイミングを誤って空気を導入してしまったこと、ユニット間のサイクル数の不一致などに関連しています。Table 2に、各プールに対応するサイクル番号を示します。

全体として、回収率は標準的なレジンベースのプロセスと同等であり、ほとんどのケースで90％以上の収率が得られました（Fig 5参照）。

Table 2. Fibro PrismAのベンチからプロセススケールまでの評価

* 今後のサイクル研究では、一貫した方法でサイクルをプールすることに焦点を当てます。
† 誤って空気を入れてしまった。

Fig 5. 異なるスケールのFibro PrismAユニットからプールした溶出液の回収率。標準的なMabSelect SuRe™ LX レジンプロセスの回収率は、青線で示すように94%でした。

パイロットユニットではわずかに減少傾向が見られましたが、これはプロトタイプのリガンドカップリングプロセスがわずかに異なっていたためと考えられます。この違いは、最終的に発売されるFibroユニットには存在しないと考えられます。さらに、小型のPilotユニットのプール3からの回収率が低かったのは、溶出前に誤ってFibroユニットに空気が入ってしまい、UVベースの溶出物の回収に支障をきたしたためです。追跡調査では、ÄKTA™システムのUNICORN™ソフトウェアでUV回収基準を最適化したところ、すべてのユニットサイズで回収率が一貫して90％以上となりました（データは示されていません）。

スケーラビリティを評価する際には、ユニットサイズ間の溶出量を測定することが重要です。しかし、溶出量は、Fibroユニットの容量に対するシステムのホールドアップ量にも関連しています。Fig 6に示すように、PilotおよびProcessユニットの溶出量は < 3 CVsでした。溶出プールの容量は、HiScreen™ Fibro PrismAユニットと比較して、より濃縮された溶出プールが得られるように、PilotおよびProcess Fibroユニットで最適化されています。HiScreen™ Fibro PrismAユニットでは、より大きなプールボリュームが期待できます。

特に、プロテインA工程からの溶出物をpH調整する場合、Fibroユニットからの溶出量が制限要因となる施設もあると考えられます。

Fig 6. 異なるスケールのFibro PrismAユニットからプールされた溶出液の溶出量（CV）。標準的なMabSelect SuRe™ LXレジンプロセスの溶出量は、青線で示すように1.9CVです。40 mL Pilotユニットのプール3の溶出量が大きいのは、溶出前に誤ってユニット内に空気を導入したことが原因です。

また、Fibroの溶出液に含まれる製品およびプロセス関連の不純物についても調べました。すべてのユニットおよびプールで生成された溶出液中のプロダクトモノマーレベルは、規制当局が通常要求するレベルを超えており、MabSelect SuRe™ LX レジンで得られた結果と同程度でした（Fig 7参照）。宿主細胞タンパク質（HCP）の低減は、Fig 8のmAbのように、mAb候補がHCPと共精製する場合には、特別な課題となる可能性があります。それにもかかわらず、Fibroの溶出液プールは、レジンベースのプロセスと比較して、HCPの削減がわずかに優れていました（Fig 8参照）。

Fig 7. 異なるスケールのFibro PrismAユニットからプールした溶出液のモノマー率。標準的なMabSelect SuRe™ LXレジンプロセスの値を青線で示します。

Fig 8. 異なるスケールのFibro PrismAユニットからのプールされた溶出液のHCPログリダクション。標準的なMabSelect SuRe™ LXレジンプロセスの値を青線で示します。

生産性と設備の適合性評価

Table 3に示すように、mAbのタイターが5g/Lの2000Lバイオリアクターについて、標準的なレジンベースのプロセス、実験的なFibro PrismAプロセス、最適化されたFibro PrismAプロセスの3つのシナリオをリストアップしました。実験的Fibroプロセスでは、プロセスの変更は最小限に抑えられました。最適化されたプロセスでは、時間を短縮し、生産性を向上させるために、ローディング密度と流量が増加しました。全てのシナリオにおいて、各サイクル後にサニタイズを行いました。

Table 3. mAb タイター 5g/L*の2000Lバイオリアクターのプロセスモデルの仮定。Fibro PrismAの値は、Mab Select SuRe™ LXの値に正規化されています。

*5 g/Lというのは大量生産を目的としたタイターの中でもリーズナブルな数値です

Table 3に示すように、Fibroを負荷範囲の下限で動作させた場合、実験的なFibroプロセスの総バッファ消費量は、レジンプロセスのそれと比較して約〜35%多くなります。これは、1000 L のポータブルタンクという設備制限があるなど、設備適合性の問題を引き起こす可能性があります。プロテインAの工程に続いて、低pHの保持が行われるため、pH滴定の工程でさらに容量が必要となります。現在の実験装置で予想されるFibroの溶出量は、このようなポータブルタンクの最大充填量に達してしまいます。この問題に対処する一つの方法は、低pHホールドの前にシングルパスTFF（SPTFF）でFibroの溶出液量を減らすことです。しかし、この方法では、循環プロセスに新たな操作上の複雑さが加わることになります。レジンベースのプロセスと比較して、1時間あたりのFibroマトリックスの量（g/L）に換算すると、生産性は少なくとも9.4倍になります。

また、他のいくつかの分子の動的結合容量（DBC）が80％であることが実証されている装填密度の上限値でFibroユニットを動作させた場合のメリットもモデル化しました。負荷容量を20％増加させ流量を33％増加させると、バッファーの消費量と溶出液の量が樹脂プロセスと同等のレベルにまで減少します。さらに、最適化されたシナリオでは、処理時間はレジンプロセスよりも短く、生産性は1時間あたりのFibroマトリックスのg/Lに換算すると約15倍になります（Table 3参照）。

Fibro PrismAが適していると思われる製造シナリオ

これらの研究に基づき、Fibro PrismAは、レジンの寿命が完全に尽きることはほとんどない臨床製造において有益であると考えられます。したがって、数バッチしか製造しない臨床プロジェクトでは、プロテインAプロセスのコストを削減ができる可能性があります。Fibroが適しているもう一つの用途は、投与量の要件が低い、あるいは患者数が少ない少量生産の商用mAb製品であるということです。このように、商業生産においても、製造頻度の低いバッチを費用対効果の高い方法で製造することができます。

他のプロテインAキャプチャーと比較して、Fibro PrismAにはいくつかの利点があります。まず、対応するバッチレジンプロセスと同じクロマトグラフィーシステムやバッファーを使用することが可能です。さらに、高い利用率と迅速な処理のどちらを優先するかを柔軟に選択することができます。最後に、プロセスのセットアップは比較的簡単です。しかし、バッファの消費量や溶出物の量は、レジンベースのプロセスに比べて多くなります。ユーザーはこれらのトレードオフをある程度克服することができます。トレードオフを最小化する方法を開発すれば、長期的な影響は最小限に抑えられます。しかし、キャンペーンのたびにカラムを詰めたり、機能テストを行ったり、何ヶ月もカラムを洗浄・保管したりする必要がなくなることのメリットは大きく、これらの活動に具体的なコストをかけることは困難です。

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