この記事は、自動翻訳ソフトウェアによって翻訳されています。自動翻訳によって生成された記事(Cytivaにより見直された記事を含む)には、単語、構文、文法などの間違いが含まれている場合があります。弊社は、コンテンツの不正確な翻訳またはその使用により生じる間違いや誤解、または損傷に対して責任を負いかねます。あらかじめご了承ください。

オリジナルの記事(英語版)はこちらから

5Lのガラス製発酵槽でのプラスミド生産のための大腸菌の増殖性能を、Xcellerex™ XDR-200 MOシングルユース発酵槽で80Lおよび160Lスケールにスケールアップした結果をまとめました。この研究では、4180bpのpLP2プラスミドを産生する大腸菌DH5α株を使用しました。600nmの光学密度(OD600)、プラスミドの力価、スーパーコイル(SC)プラスミドDNAの生成率で測定したピーク時の大腸菌の増殖性能は、試験したすべての培養量で同等でした。

XDR-200 MOソフトウェアの自動プリセット機能であるセットポイントテーブルにより、自動供給制御が可能となりました。コントロールのルックアップテーブルにより、撹拌、空気の流れ、O2の流れをカスケード制御することで、DOの全自動化が可能となりました。さらに、XDR-200 MOのインペラーデザイン(上部ピッチングインペラーと下部ラシュトンインペラー)などの設計上の特徴が、XDR-200 MOの160 Lスケールへの効率的なスケールアップに貢献しました。この結果は、XDR-200 MOのバイオリアクターが大腸菌の上流バイオプロセスに適していることを示しており、例えば遺伝子治療アプリケーションのためのプラスミドを製造する施設にとって有益であると考えられます。

はじめに

遺伝子治療薬やmRNAおよびDNAワクチンは、現在、プラスミドDNAを用いて製造されています。プラスミドDNAは、発酵槽で上流のバイオプロセスを経て大腸菌で生産されます。一般的に、ウイルスベクターやmRNAの製造をサポートするプラスミドの製造には、せいぜい数百リットルしか必要としないため、シングルユースソリューションは非常に魅力的です。

以前、われわれはXDR-50 MOバイオリアクターをいくつかのプラスミドや微生物によるVLPタンパク質の生産に使用し、600nmでの高い光学濃度(OD600)を得ています。XDR-50 MOバイオリアクターの主な特徴は、特殊なインペラーデザイン(上段ピッチドインペラー+下段ラシュトンインペラー)、高いVVMガスフロー、バッフルの採用などで、大腸菌の生育向上に貢献しています。また、シングルユースであるため、ターンアラウンドタイムが短縮され、クロスコンタミネーションのリスクも軽減されます。

シングルユースのXDR-200 MO*は、XDR-50 MOファーメンターと同じデザインで構成されています。この研究の目的は、160LスケールのXDR-200 MOファーメンターがウイルスベクターのアプリケーションに適しているかどうか、また、mRNA/ウイルスベクタープロセスの要件を満たしているかどうかを判断することです。

大腸菌の増殖とSCプラスミドDNAの発現という点で、5Lのガラス製発酵槽の性能をXDR-200でより大規模に再現できることを概念実証で示しました。

詳しいMaterials and methodsについては、このドキュメントの最後をご覧ください。

* XDR 200-MOは、細胞培養や微生物のアプリケーションに使用できるデュアルパーパス(DP)構成も可能です。

結果と考察

大腸菌の培養プロセス開発:5L ガラス製発酵槽

5Lのガラス製発酵槽にOD600を0.02とし初期培養量は2.5Lとしています。接種後8.7時間でDO値が設定値(30%)まで低下した後、あらかじめ設定したカスケード制御により空気とO2の流量を自動的に発酵槽に供給しました。開始時の供給速度は0.2mL/minに設定し細菌の比増殖速度(μ)を0.06~0.08h-1に維持するため2時間ごとに手動で10%~15%増加させました。

その成長曲線をFig 1に示します。培養終了時のピークOD600は89.2に達しました。


(A)

E. coli growth and specific growth rate/h from a 5 L fermentor along with agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.

(B)

E. coli growth and specific growth rate/h from a 5 L fermentor along with agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.


Fig 1. (A) 大腸菌の増殖をOD600で測定し、5Lガラス製発酵槽からの比増殖率/hを測定。(B)5Lのガラス製発酵槽で生産されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動分析。

サンプルは4時間ごとに採取し、-20℃で凍結しました。発酵終了時に解凍した後、サンプルをOD1.0~1.5に希釈し、プラスミド力価とスーパーコイル(SC)プラスミドの割合を分光光度計とアガロースゲル電気泳動で分析しました(Fig 1B)。ゲル中では、SCプラスミドは3000bpのマーカーとして移動し、開環状(OC)プラスミドは4000bpのマーカーとして移動します。

達成したpLP2プラスミドの力価は61.5mg/L、SC率は92.2%でした。

XDR-200 MO発酵槽での大腸菌培養プロセスのスケールアップ:培養量80L

XDR-200 MO発酵槽へのスケールアップは、5Lバイオリアクターと同様の液量/分のガス量(VVM)を維持することを基本とし、ピークVVMは0.2~0.3に制御しました。OD600が0.02、初期培養量が68Lの発酵槽に接種しました。DOの設定値は30%で、空気とO2の流れにカスケードしました。O2ガスの流量が9~10Lpmに達した時点で、DOを維持するために手動で15rpm刻みで攪拌速度を上げました。

6.5時間の発酵の後、DO値は初めて設定値(30%)まで低下しました。この時点で、空気とO2ガスがカスケード制御により自動的に発酵槽に供給されました。発酵開始から18時間後、DO値が突然115%に急上昇しました。これに伴い,空気とO2ガスの流量が大幅に減少し,栄養分が枯渇したことがわかりました。この時点で5.6mL/minでフィードを開始し(Fig 2)、比増殖率を0.06~0.08h-1に保つために2時間ごとに10%~15%ずつ手動で増加させました(Fig 3A)。

Key E. coli process parameter curves of XDR 200 MO fermentor run at 80 L culture volume.


Fig 2. 80 Lの培養量で最初に稼働したXDR 200 MO発酵槽の主要プロセスパラメーター曲線。オレンジ色の曲線=酸素、黒色の曲線=手動撹拌。


(A)

E. coli growth curves in XDR-200 MO fermentor with 80 L culture volume along with agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.

(B)

E. coli growth curves in XDR-200 MO fermentor with 80 L culture volume along with agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.


Fig 3. (A) XDR-200 MOで80Lの培養量での大腸菌の増殖曲線。(B)発酵槽で生産されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動分析。

その結果、発酵終了後にゲル電気泳動を行ったところ、プラスミドの力価は58.79mg/L、SC率は91.49%であった(Fig 3B、lane 7)。

大腸菌プロセスのスケールアップ(XDR-200 MO発酵槽:培養量160 L)

ここでは、これまでの運転に比べて、撹拌速度や送り込み量など、すべてのプロセスが自動化されています。XDR-200 MO発酵槽は、高度なDO制御モードを採用しています。DO制御ループでは、異なる空気、O2流量、撹拌速度に対応する異なるDO CV(コントローラ変数)をカスタマイズすることができ(Fig 4A)、これはガスや撹拌の制御戦略に有利に働きます。このカスタマイズ設定は、安定したDO制御を実現するだけでなく、広範囲の発泡を回避し、バッグの圧力をコントロールするのにも役立ちます。

この培養バッチでは、DOはルックアップテーブルを用いて、空気、O2の流量、撹拌速度にカスケード接続され、完全に自動制御されました(Fig 4B)。


(A)

Alt image 4: DO control cascading map to air, oxygen, and agitation speedin XDR-200 MO ferementor.

(B)

Alt image 4: DO control cascading map to air, oxygen, and agitation speedin XDR-200 MO ferementor.

(C)

Alt image 4: DO control cascading map to air, oxygen, and agitation speedin XDR-200 MO ferementor.


Fig 4. (A) MFC1(Air)、MFC6(O2)、AGT™1(撹拌速度)へのDO制御カスケードマップです。(B) DO設定の制御戦略は、ユーザーが自由に入力できる。(C) XDR-200 MO、160 L培養の場合、セットポイントテーブルでフィードレートをプリセット。

フィード量は、セットポイントテーブル(Fig 4C)のプリセットによって自動的に調整することができ、操作が簡単になります。フィード量とフィード速度のデータはすべて制御ソフトウェアに記録されるため、操作ミスのリスクが軽減され、規制上の要求をよりよく満たすことができます。

今回の実験では、ソフトウェアのコントロールセットポイントテーブルの設定により、DOとフィードの自動制御を行いました(Fig 4B、4C)。基本培地中の炭素源(栄養分)が枯渇するとフィードが開始され、発酵槽には自動的にフィード培地が追加されました。

セットポイントテーブルの設定をFig 4Cに示します。このランでの最大供給量は35mL/minに達しました(Step_12)。

発酵槽の主要ランニングパラメーター曲線をFig 5に示します。主要パラメーターであるDO(青線)、pH(緑線)、温度(赤線)は、培養プロセス全体でわずかな変動しかなく安定していました。これは、XDR-200 MO発酵槽が、この培養量ですべての主要パラメーターを優れた方法で制御できることを示しています。


Running parameter curves in XDR-200 MO fermentor at 160 L culture volume


Fig 5. XDR-200 MO発酵槽での160 Lの培養量における主要な実行パラメータ曲線。

ハーベスト時のウェイトは167kgに達し、ピーク時のOD600は95.8に達していました。ここでもフィード後の平均成長率は0.06〜0.08h-1の比成長率を維持していました(Fig 6A)。

その結果、プラスミドの力価は50.6mg/L、ゲル電気泳動によるSC率は86.6%でした(Fig 6B)。


(A)

E. coli growth curves in XDR200 MO fermentor with 160 L culture volume and agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.

(B)

E. coli growth curves in XDR200 MO fermentor with 160 L culture volume and agarose gel electrophoresis analysis of plasmid produced.


Fig 6. (A) 大腸菌の増殖曲線(XDR200 MO、160 Lの培養量)。(B)XDR-200 MO発酵槽で生産されたプラスミドのアガロースゲル電気泳動分析。

5LおよびXDR-200 MO発酵槽における大腸菌の増殖、プラスミド力価、およびSC率のまとめ

5Lガラス、および80Lと160Lの培養容積を持つXDR-200 MO発酵槽でのピークOD600は、それぞれ89.2、93.4、95.8でした。プラスミドの力価とSCの割合をTable 1にまとめました。

Table 1. XDR-200 MOでの5L発酵槽、80Lおよび160Lボリュームランでのプラスミド力価とSCパーセンテージ

Lane # Description Plasmid titer(mg/L) SC percentage (GIS method)
5 L batch 80 L batch 160 L batch 5 L batch 80 L batch 160 L batch
1 Feed 0 h 23.997 21.888 14.503 91.76% 80.36% 87.72%
2 Feed 4 h 26.249 29.299 25.942 90.08% 83.55% 88.1%
3 Feed 8 h 30.010 30.777 36.602 92.99% 92.46% 87.75%
4 Feed 12 h 29.940 30.578 35.984 90.56% 89.09% 87.46%
5 Feed 16 h 46.678 51.576 44.295 93.78% 87.8% 89.51%
6 Feed 20 h 61.509 58.79 50.639 92.24% 91.49% 91.75%

まとめ

  • XDR-200 MO発酵槽ではピークOD600が93.4から95.8に達しており、高いOD600の大腸菌の増殖に対応できることがわかった。
  • 5Lから80L、160Lにスケールアップしても、OD600のピーク値、プラスミドの力価、SC率は同等であり、XDR-200 MO発酵槽は大腸菌の増殖とプラスミドの産生に適していることがわかった。
  • 酸素移動速度(OTR)の問題は、空気に対して高い酸素2流量を組み合わせた特定の成長速度の培養条件では見られませんでした。

研究用細胞バンクの準備

本研究では、pLP2プラスミド生産用に構築されたアンピシリン耐性大腸菌DH5α株を使用しました。pLP2プラスミドはDNAのコピー数が多いプラスミドで、サイズは4180bpです。

研究用細胞バンク(RCB)を開発するために、pLP2大腸菌DH5α株を室温で融解し、1Lのシェイクフラスコに入れた100mg/Lアンピシリンを含むLB培地200mLに100μLを接種しました。23時間の生育後、OD600が0.898になった時点でRCBを調製しました。OD600が0.45になったRCBと15%グリセロールを凍結し、-80℃で保存しました。

発酵槽の培地調製

大腸菌増殖基本培地と増殖フィード培地は、Cytiva社(Fast Trak™ China)で特注したものを使用しました。すべての成分をビーカーまたはタンクに順番に加え、すべての成分が溶解するまで撹拌しました。培地を90℃以上に加熱した後、SCHOTT-DURAN™スクリューキャップガラス瓶またはNalgene™20Lバレル(Thermo Fisher™ Scientific社製)に移し、オートクレーブ滅菌を行いました。滅菌を徹底するために、20Lバレルの充填量は10L以下にしました。

プラスミドの力価とSCの割合のテスト

発酵過程では、5 LまたはXDR-200 MO(200 L)の発酵槽から、投入時点から4時間ごとにサンプルを採取し、-20℃で凍結しました。バッチ培養終了後、1バッチの全サンプルをOD600が1.0から1.5になるように希釈し、プラスミド抽出のために6mLのサンプルを採取しました。プラスミド抽出液は、力価評価のために分光光度計にセットし、プラスミド抽出液の合計2 µL (約300 ngのプラスミド)を電気泳動のためにアガロースゲルにセットしました。GISソフトウェアを用いて、ゲルからSCプラスミドの割合を求めました。

5Lガラス製発酵槽(培養量3L)での大腸菌DH5αの培養プロセス開発

解凍後、LB培地と100mg/Lアンピシリンを含む1Lシェイクフラスコに大腸菌DH5αを播種しました(Fig 7)。シェイク条件は200rpm、30℃とし、OD600で細胞密度を確認するためにサンプルを採取しました。0, 4, 8, 12, 16, 20時間後のフィードサンプルをアガロースゲル電気泳動し、プラスミドの力価とSCの割合を評価しました。


E. coli upstream culture for plasmid development workflow in 5 L fermentor.


Fig 7. (A) 5Lの発酵槽でプラスミド開発ワークフローのために大腸菌を上流で培養。

5Lの発酵槽を以下の条件で稼働させました:

  • 初期植菌量 OD = 0.02。
  • ECFT基本培地、ECFTフィード培地を2.5L。
  • 30°C; DO 30%.
  • 培養初期はpH7.00±0.3、OD=30で7.00±0.1に変化。
  • インペラの回転数は、O2ガスの流量が0.95~1.0Lpmになった時点で300~470rpmとし、手動で15rpmずつ上げていきます。
  • OD=24.4、フィード開始は0.2mL/min(つまり0.08mL/min/Lの培養液)。
  • 菌の増殖に伴い、菌の比増殖率が0.06~0.08h-1に維持されるようにフィード量を増やします。
  • 成長OD600が最大になり、増加しなくなった時点で培養をハーベストし、その後サンプルを-20℃で凍結する。

XDR-200 MO(80L培養槽)でのプロセス開発

XDR-200 MOに80 Lの培養容積で行った初回の播種をFig 8に示します。OD600での細胞密度評価のために2時間ごとにサンプリングを行いフィード時間0から4時間間隔で20時間後のハーベスト時点までに採取したハーベスト物についてゲル電気泳動を行いました。


E. coli upstream culture for plasmid development in an 80 L volume in XDR-200 MO fermentor.


Fig 8. (A) XDR-200 MO発酵槽の80 Lボリュームでプラスミド開発のための大腸菌の上流培養を行いました。

XDR-200 MO発酵槽でのこの最初の実行のための実行条件は以下の通りです。

  • 初期植菌量 OD = 0.02。
  • 68LのECFT基本培地を出発点とし、ECFTフィード培地を使用します。
  • 30°C; DO 30%.
  • 培養初期はpH7.00±0.3、OD=35.0で7.00±0.1に変化。
  • インペラの回転数は、O2の流量が9~10Lpmに達した時点で180~300rpm、手動で15rpmずつ上げていきます。
  • OD=24.8、5.6mL/minで供給開始。
  • フィード量を調整することで、比成長率を0.06~0.08h-1にコントロールします。フィード量は2時間ごとに10%~15%ずつ増加します。
  • 増殖がプラトーに達した時点でハーベストし、サンプルは-20℃で凍結保存します。

XDR-200 MO(160 L培養槽)でのプロセス開発

前回の80 Lバイオリアクターで培養した大腸菌を、Fig 9にしたがって160 Lにスケールアップしました。大腸菌DH5αの種菌を、450mLのLB培地と100mg/Lのアンピシリンを含む2Lのシェイクフラスコに5ユニット接種しました。シェイク条件は200rpmとし、OD600で細胞密度評価用のサンプルを採取しました。OD600が1.13に達した時点で、全ての種菌をXDR-200 MO発酵槽に移し、接種しました。0, 4, 8, 12, 16, 20, そしてハーベスト時(22時間)のフィードサンプルをアガロースゲル電気泳動し、プラスミド力価とSC率を評価しました。


E. coli upstream culture for plasmid development in an 80 L volume in XDR-200 MO fermentor.


Fig 9. (A) XDR-200 MO発酵槽で行われた160L容量のプラスミド開発のための大腸菌の上流培養。

この部分のXDR-200 MO発酵槽の条件は以下の通りです。

  • 初期植菌量 OD = 0.02。
  • 136.8Lの基本培地をスタートとし、培地を供給する。
  • 30°C; DO 30%.
  • 培養初期はpH7.00±0.3、OD=34.6で7.00±0.1に変化。
  • DOカスケードで空気、O2、撹拌、自動制御へ。
  • 最大撹拌速度は355rpm、最大O2ガス流量は全工程で27.7Lpmに達した。
  • OD=26.7、11mL/minで供給開始。
  • ソフトウェアの機能であるセットポイントテーブルを利用した自動送り。
  • 培養物は40~42時間後にハーベストされた。

TR29785567

CY24065-26Nov21-AN