これまで弊社では数多くのApplication Noteを作成してきました。
各種条件などを一般化した弊社発行の“Application Guide”とは異なり、実例をお見せすることで本当に実施可能なの？という不安を払拭できるものと思います。
中には現在販売していないBiacore™システムを用いた測定例をご紹介しているものもありますが、ストラテジーを変えずに現在の装置でも試験系を開発できることは、長い歴史を持ちながらも最も重要な部分が変わっていないというBiacore™の大きな強みと言えるでしょう。
そんなApplication Noteを詰め合わせにしてみました。ぜひご参考にしていただければと思います。
Application Note詰合せ
をクリックしていただきますと詳細およびApplication Noteをダウンロードいただけます
バイオ医薬品
測定技術寄り
本Application NoteはBiacore™で得られるリアルタイムデータの重要性を説いたものです。データから得られる情報量が多さにより、分子間相互作用と機能の関係を理解したり、selectivity・affinity・kineticsに基づいてヒット化合物をスクリーニングしリード化合物を最適化したり、イオン・低分子・マルチドメインタンパク質・ウイルスなどと標的の相互作用を調べたり、Yes/No binding・affinity・kineticsに基づいて抗体やタンパク質をスクリーニングし特性を明らかにしたり、活性タンパク質の濃度を測定することでタンパク質を定量化したりできます。
Hisタグタンパク質をキャプチャー法でセンサーチップ上に保持する場合、CM5チップとHis capture kitを使う方法と、NTAチップとNTA Reagent kitを使う方法の2つが提案できますが、この2つのアプローチについて測定方法、得られる結果の違いや注意点を述べたApplication Noteです。
キャプチャーの安定性はHisタグタンパク質によって異なりますが、一般的にキャプチャーを安定に保つためにはキャプチャー量をできるだけ低く保つ必要があります。安定なキャプチャーは1サイクルが長いシングルサイクル法を行う際に特に重要です。また、Hisタグの数や長さがキャプチャー効率に影響を与えることも分かっています。現在、NTA表面での親和性を向上させるためにはダブルHisタグが最適と考えられています（デカHisタグよりも良い）。タグを長くしても必ずしも親和性が高まるわけでもなく、三重タグは凝集することも示されています。
基礎研究寄り
本Application NoteはRoche Diagnostics社がBiacore™ 8Kを用いて糖化したヘモグロビン（HbA1c）を認識する抗体の結合を測定することで、血清血糖値の調節をモニターしたものです。特異性の評価のため、ヒツジ抗ウサギ抗体を固定化したセンサーチップの上にHbA1cを免疫したマウスから得られた8種類の抗体をキャプチャー、さらにHbA1cペプチドを添加しパラレルに複数の抗体の結合特性を比較しました。続いて特定の抗体に対するHbA1cペプチド誘導体との特異性試験も実施し、Biacore™8Kがペプチドなどの小さな分子でも幅広いKineticsプロファイルに対応した測定を並行して行えることを示しています。
本Application Noteでは、全身に投与された治療用タンパク質は、受容体を介したエンドサイトーシスにより血中から代謝されることから、この受容体との結合を低減することで血漿中での滞留時間を延長し高い効果を得られるという仮説を立てました。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質-1（LRP-1）は50以上のリガンドが報告されており、他の受容体による取り込みを促進する共同受容体として作用する最も重要な受容体です。Biacore™ T200とIN Cell Analyzer 2000を用いて、LRP-1との結合を抑えつつ、その後のライソゾームへの輸送を防ぐための構造的要件を備えた、新しい治療薬の候補を特定しました。
Biacore™ではLRP-1をI-IVの4つのクラスターに分割してそれぞれについて評価しています。クラスターIIIが固定化された表面の場合、ポジティブコントロールのRAPが結合すると治療薬候補分子は結合できなくなることも示されました。またグリカンレセプターとの結合も確認しています。in vitroでの受容体結合と糖鎖プロファイルの結果は、クリアランスの少ない新規分子の探索ツールとして使用できることを示しました。リソソームへの取り込みや輸送がないことはIN Cell Analyzer 2000を用いた細胞アッセイで確認しています。
このApplication Noteでは、細胞質ホスホリパーゼ2（cPLA2）とプロテインキナーゼC-α（PKC-α）の特異的な細胞内ターゲティング特性のメカニズムを説明するデータを紹介しています。
細胞内シグナル伝達の特徴の一つに、細胞の活性化に伴ってシグナル伝達タンパク質が特定の細胞膜に移動することがあります。この種のトランスロケーションに関与する保存された構造ドメインのいくつかは特定されていますが、その基礎となる分子メカニズムはまだ完全には証明されていません。
cPLA2とPKC-αはともにC2ドメインがあり、これがカルシウム依存性の膜ターゲティングに重要であることが分かっています。cPLA2はホスファチジルコリン（PC）に優先的に結合し、核周辺に移動する一方、PKC-αは細胞膜に移動し、ホスファチジルセリン（PS）に選択的に結合します。筆者らはこの2つの特性を解析するため、Biacore™とライブセルイメージングを並行して行っています。その結果、C2ドメインの細胞内ターゲティングが、脂質結合特性に関係していることを示しました。
Biacore™ではPOPC、POPS、POPGを利用して核周辺および細胞膜のモデル膜を調製しチップ表面にコートしたものに対して0.1MのCA2+を含むランニング緩衝液中でcPLA2-C2およびPKC-α-C2を添加して相互作用解析し、C2ドメインのCa2+結合ループにある複数の変異を解析することで、リン脂質の親和性と選択性に重要な役割を果たす個々の残基を特定することができ、さらにkinetics解析により脂肪族残基が主に結合の安定性に寄与し、芳香族残基は膜の結合と解離ステップに関与している可能性を示唆するデータが得られました。
本Application Noteでは受容体とリガンド間の相互作用の動力学的プロファイルが細胞機能を制御している仮説を検証しています。
T細胞受容体のペプチド-MHC複合体に対する認識
抗原ペプチドとクラスⅡ MHC分子の両方における個々のアミノ酸残基の寄与を分析することで、抗原ペプチドの残基の変化はTCRの解離速度に影響を与えますが結合速度には影響を与えず、またMHCの残基の変化はTCRの結合速度に大きく影響しますが解離速度にはあまり影響しないことが分かりました。
低親和力FcγRによるIgG認識
FcγRIIIは重鎖と軽鎖の両方の下部ヒンジ領域にあるエピトープでIgGに結合しますが、アスパラギン残差297に結合したオリゴ糖はFcγRIIIの認識モチーフに非常に近く、ヒンジ領域を安定化させ、分子の惨事構造を維持することで受容体の結合に寄与していると考えられています。ネイティブと脱グリコシル化した抗体を比較すると受容体への親和力は10倍近く減少しました。またこのヒンジ領域に由来するペプチドも測定することで、これが自己免疫IgGを介した疾患の治療アンタゴニストとして有用であることを示唆するデータも得られました。
自然免疫システムの細胞表面受容体
NK細胞は細胞表面のレクチン様受容体NKG2Dを介して活性化されますが、これと特定の主要に発現するMHCクラスⅠ様リガンド（いくつか既知のうちの2つがRAE-1δとRAE-1B6）との相互作用を研究しました。解離速度の速いRAE-1δは最も感度の高い反応のみを誘発しますが、解離速度の遅いRAE-1B6はより幅広い機能を促進する可能性があることを示しました。
血管内皮細胞成長因子VEGFとその受容体についてBiacore™で検証したApplication Noteです。
VEGF-Dに対するMAbsの特性解析とエピトープマッピング（※ビニングが正しいと思われます）
腫瘍の進行におけるVEGF-Dの役割を調べるために4種類のMAbs（VD1-4）を作製し、Biacore™で特性解析しました。それぞれ高い親和力で結合しましたが、結合速度と解離速度には顕著な違いが見られました。さらに固定化されたVEGF-Dに対し1つ目の抗体が結合した状態で2つ目の抗体を添加することでエピトープマッピングを行うと、VD1-3抗体は類似または同一のエピトープに結合しましたが、VD4抗体は異なるエピトープに結合していました。細胞アッセイではVD1-3抗体を用いることでVEGF-DがVEGFR-2やVEGFR-3との結合を阻害していること示されましたが、SPRによりVD1-3がVEGF-Dに結合することで阻害していること、およびVEGFR-2とVEGFR-3はVEGF-Dに対して類似または同一の領域に結合することが明らかになりました。
VEGFアンタゴニストの速度論的評価
VEGF-Aの主要なバリアントであるVEGF-165はVEGFR-1およびVEGFR-2を活性化するため重要な分子です。これらの受容体の膜貫通ドメインが欠損した可溶性の組換え型を用いると、VEGF-165を封じ込め膜貫通型の受容体との結合を阻害することができ、血管新生を阻害して腫瘍の成長を防ぐことができる可能性があります。SPRではこの組換え型を固定化し、VEGF-165との相互作用を確認しました。
腫瘍バイオマーカーとしての抗体フラグメントの最適化
ファージライブラリから得られるヒト抗体フラグメントは、全長抗体と比較してBioavailabilityの向上が期待されます。細胞外マトリックスタンパク質であるフィブロネクチンの一種であるB-FNのアイソフォームであるED-Bは正常な成人組織には存在しません。筆者らは腫瘍組織で見られるED-Bに特異的な抗体フラグメントを設計し、さらにBiacore™にて抗体フラグメントライブラリをスクリーニング、固定化されたED-Bとの相互作用プロファイルを比較しました。これにより画像診断に最適な抗体フラグメントを選択する上で有用であることを示しました。
テロメラーゼによるテロメアの伸長反応をBiacore™上でモニターするという大変ユニークな方法です。テロメラーゼ活性の測定についてはPCRベースのアッセイ系が開発されていましたが、アーチファクトが大きいことや作業の煩雑さから、Biacore™によるアッセイ系が開発されました。培養細胞および腫瘍細胞サンプルからのテロメラーゼ抽出物を添加しています。
生産・品管寄り
このApplication Noteでは、バイオシミラー分子であるインターフェロンα-2a（IFNα-2a）のハイスループットプロセス開発においてBiacore™T200と Amersham™ WBシステムの仕様が例示されています。Biacore™はリフォールディングの段階から濾過を経て、キャプチャー、中間精製、Polishingの3つのクロマトグラフィー精製の段階まで幅広く使用され、(1)先行品との比較評価、(2)最適なリフォールディング条件の発見、(3)最適なクロマトグラフィー樹脂の選択、(4)結合および溶出ステップの最適化の検討に使用されました。Amersham™ WBでは純度、先行品との同一性を確認しています。
Biacore™では正しくフォールディングされたIFNα-2aあるいはアンフォールドなIFNα-2aと結合活性を持つ2種類の抗体をそれぞれリガンドとして用いたCFCA解析による濃度定量、およびIFNα/β receptor2を用いたKinetics解析を実施しています。本Application NoteではDesign of Experiment（DoE）のアプローチを併用している点が特徴的です。リフォールディング条件検討ではpH、アルギニン濃度、希釈率、グルタチオン還元システムなどを検討しています。クロマトグラフィー樹脂選択のうち、例えば中間精製では様々な組成のバッファーでリンスしたCapto™ MMC ImpRes、Capto™ adhere ImpRes、Capto™ Q ImpResの3種類について、塩濃度やpH条件を多点振り、最適な条件を検討しています。その他、各精製ステップにおけるKinetics解析も実施して結合活性を検証しています。
このApplication Noteでは、熱、光、pH、酸化ストレスによる立体構造の変化を認識するための立体構造認識抗体（本論でのBMSR）を用いることによる、ヒト化モノクローナル抗体の完全性試験の新しい手法を紹介しています。ストレスを受ける前後で結合パターンに大きな違いが確認されました。酸化メチオニン、脱アミド化アスパラギン、二量体の含有量の検出限界は0.4-4%の範囲でした。
低分子医薬品と比べて構造が複雑で、複数の標的分子に高い特異性を持って結合するバイオ医薬品は、開発時や品質管理において構造的な完全性や活性を評価するために様々な分析技術が用いられています。このwhite paperではBiacore™を用いた活性濃度測定、標的との結合、FcRの分析、およびこれらのアッセイを用いた医薬品のpotencyとstabilityの評価について解説しています。
内容が多岐にわたるためここでは全てを解説いたしませんが、バイオ医薬品のCQAのうち何かが変化するとすぐにBinding activityとconcentrationに影響を及ぼすことが想定され、したがってこれを正確に評価できるBiacore™は特に有用であることを示しています。現在のバイオ医薬品Late stageにおけるBiacore™のエッセンシャルが詰まった非常に良い資料の一つで、大変お勧めです。
成長を続けるバイオシミラーについて、バイオシミラーメーカーは「安全性、純度、および有効性に関して、バイオシミラーと先行医薬品との間に臨床的に意味のある差がない」ことを示す必要があります。バイオシミラリティの証明には構造解析上、および機能解析上で高度に類似していれば（fingerprint-like）、in vivo動物実験及び臨床試験の計画、実施を行う際に、よりターゲットを絞った選択的なアプローチをとることができます。
本Application NoteではSartorius Stedim BioOutsource社がADCCを引き起こす様々なバイオシミラー抗体について、細胞ベースアッセイと並行してBiacore™を使用してその相関性を確認しています。結果、ADCC活性が高い（＝細胞死率が高い）時、FcγRIIIaに対する抗体の親和性（KD）も強くなっていることが確認できました。相対的結合レスポンスは親和性よりもさらに強い相関も見られることが分かりました。これにより、Biacore™アッセイはADCC活性予測の指標となることが示されました。
低分子
基礎研究寄り
本Application NoteではC型肝炎ウイルス（HCV）の持つウイルス性タンパク質NS5B 1bのThumb IIポケットにアロステリックに結合する新規フラグメントの探索（500フラグメントを20時間）を行っています。mMオーダーの弱い親和力のフラグメント16 hitsを選出、うち6個はアロステリックサイト結合の可能性が示唆されました。この研究ではThumb IIポケットに結合することで構造変化を促しNS5Bの酵素反応を抑制するフィリブビルをポジティブコントロールとしています。治療用として用いられているソホスブビルはフィリブビルとはMOAが異なり、ソホスブビルを補完するようなフラグメントの探索が目的になります。
NS5Bは24時間で結合活性を失う、不安定なタンパク質です。Biacore™ 8Kではその処理速度を存分に活かし、失活する前に測定しきることが可能でした。フラグメントスクリーニングの王道的な流れとして、Clean screen、Binding level screen、Affinity screenを実施して確認しています。
探索・最適化寄り
自己免疫疾患ではT細胞の活性化を止めることが強力な治療法になります。抗原提示細胞APCは細胞表面上にMHC分子を持ち、これに抗原を提示します。Avidex社はAPC上のCD80細胞がヘルパーT細胞上のCD28と結合し活性化させる経路を阻害する低分子化合物を探索しています。化合物のkinetics解析によりグルーピングすることで興味深いデータも得られました。
はじめにCD80のみと結合する化合物を探索しました。ビオチン標識rCD86、rCD80をSAチップに固定化後、化合物を添加し選別します。続いてCD80-mouse Fab複合体とcd28-mouse Fc複合体をそれぞれドナー、アクセプターとしてTR-FRETを用いて評価しました。結果、大体の化合物はBiacore™で得られるKD値とTR-FRETの結果とで相関性がありましたが、いくつかの化合物は相関しませんでした。興味深いことに、これらの化合物は細胞障害活性が見られています。またBiacore™で阻害アッセイも実施していますが、CD28よりも100倍強い親和力を持つ化合物5つを見出し、さらにそれらの派生物のうち1つのグループはその他4つのグループと比較して異なるkineticsプロファイルを持つことも分かりました。
ヒトのポリADPリボースポリメラーゼファミリーの一員であるPARP1の阻害剤についてBiacore™T200を用いて選別したApplication Noteです。スクリーニング、kineticsのプロファイリングまでBiacore™で行うことで結合メカニズムの情報を得て、さらにDSFを用いた結果と比較しています。今回の検証では、DSFでは弱い阻害剤は同定できず、また親和性ランキングもできませんでした。
スクリーニングの段階ではHisタグ付きPARPファミリーのTNKS1/2、およびPARP15はNTAチップを用いたクロスリンク法で固定化されました。続いて184種の化合物30μMを60secかけて添加、10分かけて解離させています。その次にkineticsプロファイリングを行う際は同様にNTAチップを用いますがクロスリンク法は取らず、キャプチャー法でデータ取得しています。最終的に8個の化合物が選別され、活性部位が非常に近いTNKS1とTNKS2にもかかわらずTNKS2に高親和性なものを選別できていたり、TNKS1よりもPARP15に対する選択性の高いものを選別可能でした。
一方でDSFアッセイでは、PARP15ではかなりヒット率が低くなりました。本研究ではDSFアッセイはKD＝50μMの検出に限界があり、化合物の道程を困難にしています。KDが1μMに近い化合物でも、Tmの変化の幅はかなり大きく統計的優位性に欠けました。これはDSFデータが高温での相互作用を表しており、ΔTmの大きさと整理温度での親和性には単純な関係がないためです。そのため、SPRによるより直接的で高感度なアッセイが向いていると評価しています。
ワクチン・ウイルス
測定技術寄り
このApplication NoteではBiacore™でアデノウイルス（AdV）の濃度を測定する2つのアッセイ方法（それぞれCARとFX）を紹介しています。CARはAdVのファイバータンパク質と、FXはAdVのCapsidタンパク質と結合します。Biacore™での測定結果はアッセイ時間と作業時間を大幅に短縮できるメリットの他、再現性が高く堅牢な性能を示しただけでなく、qPCRとも強い相関性を示しました。
インフルエンザワクチンに含まれるウイルスのヘマグルチニン（HA）と宿主細胞タンパク質（HCP）の定量に使用されています(*)。HA法は、現在主流のSRID法と比較して高い感度、精度、回収率を示し、かつ分析時間も短く済みます。HCP法はブラッドフォード法と比較して、より高い感度と特異性を示しています。Biacore™で行われるアッセイは、既存の方法論を補完あるいは取って代わるものとして、ワクチンの開発や製造のオペレーションを大きく改善する可能性を示しています。
(*) 現在のHCP分析の主流はELISAであり、Biacore™では残念ながら感度が不足しているため現状では難しいと思われます。参考としてご覧ください。
生産・品管寄り
フラビウイルスワクチンの開発・製造には多くの課題があり、スペースとリソースを必要とします。このWhite paperでは、フラビウイルスワクチン製造の上流・下流プロセスに柔軟性とスピードをもたらす最新のツールとソリューションを紹介しています。シングルユースのバイオリアクターやクロマトグライー精製カラムは、クロスコンタミネーションのリスクを低減し、オペレーターの安全性を高めるとともに、コストと時間のかかる洗浄作業を排除することで、製品化までの時間を短縮できます。下流プロセスでは、最新のクロマトグラフィー樹脂が高い選択性と優れた圧力-流量特性を提供し、製造スケールの生産における高い生産性を実現します。
本Application NoteではBiacore™の実例はありませんが、以下のように紹介されています。：SPRを利用したラベルフリーの分子間相互作用解析は、ワクチンの定量、製造時の分析や品質管理などの分野で広く利用されています。