組織分散用酵素
Dissociation Enzyme Mix
お客様の声
以下の各サンプル組織をクリックいただくことでフィルタリングしていただけます。
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組織:肝臓
大阪大学 松井理司先生・武部貴則教授ご協力による検証レポート
Dissociation Enzyme mix B (Liver) を用いた分散法を現行法と比較しました。
結果、マウス肝臓・ヒト肝オルガノイドで細胞生存率・分離効率で良好な結果を得ることができました。
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組織:肺
お客様の声 No 001 投稿者 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所 微生物部細菌課
安楽 正輝 様普段組織分散に使用している酵素・キット名 各種コラゲナーゼ サンプル情報 動物種・組織名 マウス(肺) 分散前サンプル量(mg) 30mg / 45mg 使用製品情報 製品コード 29740243 製品名 Dissociation enzyme mix A 実験条件 温度 37 ℃ 酵素処理時間 30(30mg)or 60 min(45mg) 分散に使用した方法 マニュアル 結果 細胞数(cell/ml) 30mg: 2.92 x 10^6 / 3.98 x 10^6 cells/ml
45mg: 8.27 x 10^6 / 1.09 x 10^7 cells/ml
いずれもtotal 3.5ml/sampleに懸濁(HBSS 3ml + 酵素液0.5ml)細胞生存率(%) 30mg: 73.4 %
45mg: 75.9 %細胞カウント方法 全自動セルカウンター SOL COUNT お客様コメント 使用してみての感想:間質系の組織をフィルター上で分散させる際に、非常に柔らかく通りが良いのを実感しました。通常、うまく分散しない場合はフィルターで潰すので、生存率を確保できなかったりすることがあるので、今回の試薬は30分で期待以上の感触でした。FACSでもダブレットを確認できるものの、期待以上にシングレットが分取できたと考えております。組織重量に差がありますが、60分では若干細胞にダメージが出ている様子です。総合的にscRNA-seqを行う際などの分散試薬として、使用していきたいと考えさせて頂きました試薬でした。
解析条件
セルソーター:BD FACS Melody
染色試薬:7-AADCytivaからのコメント 通常、コラゲナーゼ使用時には処理時間60minで生存率は60-70%、収率は今回の弊社試薬の方が格段に上との事でした。また、FACSでのダブレッツの数もコラゲナーゼに比べて少ない様に感じたとの事です。
組織:Human PDX
お客様の声 No 002 投稿者 非公開 普段組織分散に使用している酵素・キット名 Gibco TrypLE サンプル情報 動物種・組織名 Human PDX 分散前サンプル量(mg) 100 mg 使用製品情報 製品コード 29740243 製品名 Dissociation enzyme mix A 実験条件 温度 37 ℃ 酵素処理時間 15 min 分散に使用した方法 マニュアル 結果 細胞数(cell/ml) - 細胞生存率(%) Cytiva TripEL Sample #1 Sample #2 Sample #3 Sample #4 Sample #5 Sample #6 Live cell number 25900 21000 19100 15000 14600 14500 Viability (%) 85 79 64 62 61 74 細胞カウント方法 LUNA-II Automated Cell Counter お客様コメント 本アッセイにはマウスに生着したhuman-PDXを回収し、直接分散アッセイに使用しました。腫瘍の破砕にはコラゲナーゼを使用することが多いですが、細胞死の割合が非常に多いので今回は比較対象にGibco TrypLEを使用し、細胞死を抑えてアッセイを実施しております (生細胞数を増やしております)。
その結果、上記条件下でも、御社の試薬が組織分散能、細胞生存率が高いことがわかりました。
当研究室ではPDXアッセイをよく実施するのですが、一般的な手法のようにPDXをハサミやナイフでカットし、マウスに移植する場合に移植組織量のブレが出やすいのが問題でした。今後は御社の試薬でマウスから回収したPDXを1度分散し、細胞数をカウントし揃えた状態でそのまま次のマウスへ移植することで均一なPDXの移植が実施できそうですあると実感しております。
※ただし1点問題点ですが、Cytiva試薬は十分にwashして洗い流さないと (最低3回程)、試薬の活性が残ってしまう傾向があるように感じました。PADXを御社試薬にて破砕後1回のwash (大量PBS) を挟んでMatrigelで培養したのですが、1回のwashではMatrigelが溶解する傾向がありました。
組織:肺
お客様の声 No 003 投稿者 富山大学 和漢医薬学総合研究所 がん・免疫ユニット
佐々木 宗一郎 様普段組織分散に使用している酵素・キット名 Collagenase D サンプル情報 動物種・組織名 C57BL/6J、肺 分散前サンプル量(mg) 120 mg 使用製品情報 製品コード 29740243 製品名 Dissociation enzyme mix A 実験条件 温度 37 ℃ 酵素処理時間 30 min 分散に使用した方法 マニュアル 結果 細胞数(cell/ml) 1.03 x 107 cells 細胞生存率(%) 96.0 % 細胞カウント方法 血球計算盤 お客様コメント 酵素をCollagenase Dで行った場合は、
細胞数 0.428 x 107 cells (92.3 %)
回収された細胞数は、FACSの解析結果からサンプル中のNK細胞の割合は同等であったため、最終的なNK細胞の収率は倍以上になった。Cytiva担当者コメント 収率については想像以上の有効性が得られた一方で、CD27抗原が切断・損傷された可能性が示唆されたため、FCM解析でCD27抗原を保持するためには、さらなる最適化(異なる抗体クローン検討、酵素濃度、処理時間など)が必要だと考えられる。(FCMデータ参照)
組織:肝臓
お客様の声 No 004 投稿者 富山大学 和漢医薬学総合研究所 がん・免疫ユニット
佐々木 宗一郎 様普段組織分散に使用している酵素・キット名 Collagenase D サンプル情報 動物種・組織名 C57BL/6J、肝臓 分散前サンプル量(mg) 1000 mg 使用製品情報 製品コード 29751004 製品名 Dissociation enzyme mix B 実験条件 温度 37 ℃ 酵素処理時間 37 min 分散に使用した方法 マニュアル 結果 細胞数(cell/ml) 9.02 x 106 cells 細胞生存率(%) 95.8 % 細胞カウント方法 血球計算盤 お客様コメント 酵素をCollagenase Dで行った場合は、
細胞数 3.29 x 106 cells (93.3 %)
回収された細胞数は、FACSの解析結果からサンプル中のNK細胞の割合は同等であったため、最終的なNK細胞の収率は倍以上になった。
組織:胃
お客様の声 No 005 投稿者 非公開 普段組織分散に使用している酵素・キット名 Collagenase, Pronase サンプル情報 動物種・組織名 マウス、胃 分散前サンプル量(mg) 50 ~ 100 mg 使用製品情報 製品コード 29740243 製品名 Dissociation enzyme mix A 実験条件 温度 37 ℃ 酵素処理時間 30 min 分散に使用した方法 VIA Extractor™ 200 rpm 結果 細胞数(cell/ml) 1.75 x 10^6 cells 細胞生存率(%) 90 % 細胞カウント方法 血球計算盤 お客様コメント VIA Extractor を使用した結果、従来のマニュアル手法と比較して、より短時間で効率的に組織をシングルセル化することができました。細胞生存率も高く、シングルセル解析に十分な細胞数を確保できたため、総じて非常に良好な結果が得られたと感じております。また、これまで使用していた酵素(Collagenase、Pronase)と Enzyme A を比較したところ、細胞生存率に大きな差は認められませんでしたが、Enzyme A の方がよりシングルセル化していました。 Cytiva担当者コメント 今回、弊社の組織分散装置VIA Extractorのデモと並行して酵素試薬の評価をおこなっていただきました。マニュアル手技と比べて弊社の組織分散装置を使用したことによる結果への影響が大きかったため、酵素試薬の比較結果では大きな差が認められなかったとの事です。
組織:肺、皮膚
お客様の声 No 006 投稿者 非公開 普段組織分散に使用している酵素・キット名 Collagenase NB8 (Nordmark), Collagenase (富士フィルム), Liberase TM (Roche), Dispase (Roche), etc.
※皮膚はCol/Dis処理後、TrypLE 15分処理サンプル情報 動物種・組織名 マウス、肺、皮膚 分散前サンプル量(mg) 肺:35-39 mg, 皮膚:30 – 39mg 使用製品情報 製品コード 29740243 製品名 Dissociation enzyme mix A 実験条件 温度 37 ℃ および 0 ℃(肺)、37 ℃ (皮膚) 酵素処理時間 37 ℃:40分、4 ℃:2時間 分散に使用した方法 マニュアル 結果
Col:Collagenase NB8 0.2% /Dispase 2.5U/mL/DNase 37℃ 1hr
*SkinはCol/Dis処理後、TrypLE 15min処理
LC: leukocytes
End: Endothelial cells
FB: Fibroblast
SMC: smooth muscle cells
Epi: Epithelial cells
細胞カウント方法 フローサイトメトリー お客様コメント 全体としての印象ですが、回収細胞数および構成細胞のバランスはいずれも期待以上でした。また、4℃で2時間(40分ごとにピペッティング)でも十分な消化が得られたのも印象的でした。10分おき程度のピペッティングでさらに短時間化できる可能性があります。
※4℃の場合、反応時間を延ばす以上に、ピペッティングにより組織内へ酵素を浸透させることが重要という印象を受けました。
CD31、CD45、CD326、CD140a、CD146などのLineageマーカーは、Collagenase/Dispase処理と同等に保持されていました。
組織:肝臓
お客様の声 No 007 投稿者 非公開 普段組織分散に使用している酵素・キット名 Collagenase NB8 (Nordmark), Collagenase (富士フィルム), Liberase TM (Roche), Dispase (Roche), etc.
※皮膚はCol/Dis処理後、TrypLE 15分処理サンプル情報 動物種・組織名 マウス、肝臓 分散前サンプル量(mg) 60 – 63 mg 使用製品情報 製品コード 29751004 製品名 Dissociation enzyme mix B 実験条件 温度 37 ℃ および 4 ℃ 酵素処理時間 37 ℃:40分、4 ℃:2時間 分散に使用した方法 マニュアル 結果
Col:Collagenase NB8 0.2% /Dispase 2.5U/mL/DNase 37℃ 1hr
LC: leukocytes
End: Endothelial cells
FB: Fibroblast
SMC: smooth muscle cells
Epi: Epithelial cells
細胞カウント方法 フローサイトメトリー お客様コメント 全体としての印象ですが、回収細胞数および構成細胞のバランスはいずれも期待以上でした。また、4℃で2時間(40分ごとにピペッティング)でも十分な消化が得られたのも印象的でした。10分おき程度のピペッティングでさらに短時間化できる可能性があります。
※4℃の場合、反応時間を延ばす以上に、ピペッティングにより組織内へ酵素を浸透させることが重要という印象を受けました。
CD31、CD45、CD326、CD140a、CD146などのLineageマーカーは、Collagenase/Dispase処理と同等に保持されていました。
組織:脳
お客様の声 No 008 投稿者 名古屋大学 医学系研究科
西村 建徳 様普段組織分散に使用している酵素・キット名 今後、ミルテニー社のMulti Tissue Dissociation Kit 1と比較予定 サンプル情報 動物種・組織名 マウス、脳 分散前サンプル量(mg) 大脳全脳 使用製品情報 製品コード 29740240 製品名 Dissociation enzyme mix C 実験条件 温度 0 ℃ 酵素処理時間 30分 分散に使用した方法 マニュアル 結果 細胞数(cell/ml) 7.5 x 105 cells total 細胞生存率(%) - 細胞カウント方法 血球計算盤 お客様コメント - 特にaggregationもなく、細胞を回収できた。
- マニュアルでもできるため、ランニングコストを最小限にして実験できる点が他社と大きく異なると感じた。
- Epitope integrityのデータが事前にわかっているとよいと思った。現在、脾臓を用いてEpitope integrityを確認している。
- できれば瓶を大きめにしてもらえると溶解の手間が少なくなると感じた(今の使用だと別容器に一回移したあとにaliquotを作成しないといけない)。必要量のPBSを入れて、ふたをして転倒混和して溶かして、その後、小分注できれば楽かと思った。
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